汪孝軍，喻福娟，阿 智，肖崇雅

(阿壩藏族羌族自治州人民醫(yī)院眼科，四川 阿壩藏族羌族自治州，624000)

角膜炎是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家患者失明的主要原因之一[1]。銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是角膜炎的一種主要革蘭氏陰性致病菌，其發(fā)病迅速并可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害[1-2]。銅綠假單胞菌能侵入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制[3-6]。有研究[4]顯示，在實(shí)驗(yàn)性銅綠假單胞菌感染角膜炎動(dòng)物模型中，即使眼內(nèi)已無細(xì)菌生長(zhǎng)，但眼內(nèi)仍存在炎癥反應(yīng)，提示已滅活或崩解的細(xì)菌及其成分也存在一定的致炎作用。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)已被廣泛地應(yīng)用于葡萄膜炎的治療研究[7]，目前已被證實(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的自噬[8]，而細(xì)胞自噬在清除病原體中起著重要作用[9]。因此，本研究旨在探討DHA能否通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除，最終用于銅綠假單胞菌角膜炎的治療。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用50只6～8周齡(20～24 g)雌性SPF級(jí)野生型C57BL6J小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(京)2019-0009]，動(dòng)物治療符合ARVO在眼科和視力研究中使用動(dòng)物聲明和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，所有程序都經(jīng)過動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要材料及儀器

人角膜上皮細(xì)胞系HCEC和CP-H128(武漢普諾賽生命科技有限公司)；人角膜上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-H128，武漢普諾賽生命科技有限公司)；銅綠假單胞菌(分離自本院收治的銅綠假單胞菌角膜炎患者的角膜刮片樣本，根據(jù)角膜刮片形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特征和16s rDNA序列分析鑒定為銅綠假單胞菌，保存在-80 ℃)；LB培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)；氯喹(CQ)、雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA，美國(guó)Sigma公司)?？贵w：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、P62、核因子kappaB(NF-κB)、NF-κB抑制因子α(IκBα)、p-IκBα、Lamin B、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)；羊抗兔HRP二抗(美國(guó)Invitrogen公司)；TRIzol(美國(guó)Life Technologies公司)。Zeiss Axio Scope A1型熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3 菌液的制備

采集細(xì)菌菌落，在37 ℃的胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中不斷搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。次日，將20 μL含有銅綠假單胞菌的TSB轉(zhuǎn)移到4 mL新鮮培養(yǎng)基中，在OD 600 nm<1的條件下培養(yǎng)4 h。測(cè)定TSB細(xì)菌濃度后，將細(xì)菌洗滌復(fù)蘇，然后感染小鼠角膜或置于沸水浴中5 min，產(chǎn)生熱滅活銅綠假單胞菌，用不含生長(zhǎng)因子和抗生素的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞處理和分組

將融合培養(yǎng)的HCEC細(xì)胞在CM-H128培養(yǎng)基中饑餓過夜，隨后，用熱滅活銅綠假單胞菌(MOI=1:100)感染達(dá)到指定時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)。將銅綠假單胞菌感染5 h后的HCEC細(xì)胞分為空白組、CQ組(5 μmol·L-1CQ預(yù)處理30 min，加入生理鹽水培養(yǎng)24 h)、不同濃度DHA組(生理鹽水預(yù)處理30 min，分別加入10、20、40 μmol·L-1DHA培養(yǎng)24 h)、DHA+CQ組(5 μmol·L-1CQ預(yù)處理30 min，加入40 μmol·L-1DHA培養(yǎng)24 h)，觀察DHA誘導(dǎo)HECE細(xì)胞自噬的劑量-反應(yīng)曲線及DHA對(duì)HCEC細(xì)胞自噬的影響。

1.5 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

收集HCEC細(xì)胞(1×107個(gè))，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，離心獲取上清，用BC法檢測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣本取40 μg總蛋白，進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。用含體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶的BSA封閉液封閉4 h，隨后使用TBST清洗5 min×3次，最后將膜與一抗4 ℃孵育過夜。次日，與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG共孵育2 h。用ECL發(fā)光液進(jìn)行蛋白條帶可視化。

1.6 免疫熒光法分析細(xì)胞LC3表達(dá)

HCEC細(xì)胞(1×105mL-1)感染銅綠假單胞菌1 h后，用體積分?jǐn)?shù)4% PFA固定，體積分?jǐn)?shù)0.3% Triton X-100通透，體積分?jǐn)?shù)5% BSA封閉。用兔抗LC3B抗體孵育1 h，然后用Alexa Fluor?488熒光抗兔IgG孵育。使用Dako熒光封片劑將蓋玻片封固在顯微鏡載玻片上。置于熒光顯微鏡下觀察。定量檢測(cè)每個(gè)樣品中LC3陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

1.7 分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)

收集HCEC細(xì)胞(1×107個(gè))，用預(yù)冷的PBS洗滌2次并重懸于500 mL緩沖液A(含有10 mmol·L-1HEPES，pH=7.9、1.5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1KCl、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1PMSF、1 mg·mL-1亮抑酶肽、1 mg·mL-1抑肽酶和1 mg·mL-1胃酶抑素A)中。使細(xì)胞在冰上孵育15 min，然后用12.5 mL體積分?jǐn)?shù)10% Nonidet P-40溫和裂解，并在4 ℃下以2000 r·min-1離心10 min。收集上清液并用作細(xì)胞質(zhì)提取物。將沉淀物(含有核)重新懸浮在40 mL緩沖液C(20 mmol·L-1HEPES，pH=7.9、1.5 mmol·L-1MgCl2、450 mmol·L-1NaCl、體積分?jǐn)?shù)25%甘油、0.2 mmol·L-1EDTA、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1PMSF、1 mg·mL-1亮抑酶肽、1 mg·mL-1抑肽酶和1 mg·mL-1胃酶抑素A)中，在4 ℃攪拌30 min，核碎片以2000 r·min-1離心15 min。上清液即為核提取物。將胞核和胞質(zhì)樣本分別進(jìn)行Western Blot法檢測(cè)NF-κB蛋白和LC3蛋白表達(dá)，分組與處理方法同“1.4”。

1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

根據(jù)體重和隨機(jī)數(shù)字表法將C57BL6J小鼠分為6組：假手術(shù)組、模型組、CQ組、雷帕霉素組、3-MA組、DHA組，除模型組(n=25)外，其余各組均5只。腹腔注射0.3 mL戊巴比妥鈉(體積分?jǐn)?shù)0.06%)進(jìn)行全身麻醉，隨后使用鹽酸丙美卡因滴眼液(蘇州天龍制藥有限公司，批號(hào)：20190104，規(guī)格：每支10 mL)進(jìn)行角膜局部麻醉。使用1 mL注射器針頭，在顯微鏡下將小鼠角膜上皮劃3條1 mm損傷。隨后將小鼠平放置鼠籠，除假手術(shù)組外，其余5組小鼠在眼表滴加10 μL銅綠假單胞菌菌液(107個(gè)·mL-1，懸浮于生理鹽水)。于處理后24 h用手持裂隙燈觀察，如果血管充血、角膜混濁或者積膿即為造模成功。CQ組、雷帕霉素組、3-MA組、DHA組分別于術(shù)前1 d起每日用CQ(30 μmol·L-1)、雷帕霉素(3 μmol·L-1)、3-MA(3 mmol·L-1)、DHA(40 μmol·L-1)每日點(diǎn)眼6次。假手術(shù)組和模型組用等體積生理鹽水代替。

1.9 角膜組織銅綠假單胞菌載菌量檢測(cè)

24 h后，使用斷頸法處死小鼠，將小鼠眼球取下，并在體式顯微鏡下沿角鞏膜緣將角膜剪下。使用含有TissueLyser的生理鹽水(100 μL)清洗剪下的小鼠角膜后，將角膜放入盛有1 mL胰蛋白酶工作液的離心管中，使用眼科剪在管中持續(xù)剪切10 min。將原液分別稀釋10、100、103、104、105、106、107倍，取每種濃度梯度的菌液10 μL，涂布于LB培養(yǎng)皿中(每個(gè)濃度梯度設(shè)置3組重復(fù))，置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。次日計(jì)數(shù)形成的菌落數(shù)，依據(jù)稀釋梯度計(jì)數(shù)角膜載菌量，以菌落形成單位(CFU)表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌處理HCEC細(xì)胞后細(xì)胞自噬活性變化

將熱滅活銅綠假單胞菌(MOI=1:100)感染HCEC細(xì)胞不同時(shí)間后，經(jīng)Western Blot法檢測(cè)自噬標(biāo)記物 LC3蛋白。結(jié)果顯示在感染后1 h即可觀測(cè)到LC3蛋白表達(dá)顯著增加[(0.83±0.09)比(0.50±0.07)，P<0.05]，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3II/LC3I蛋白比值逐漸增加(2 h：0.87±0.12；3 h：0.90±0.09；4 h：1.09±0.14；5 h：1.34±0.15，P<0.05，見圖1A)。此外，以雷帕霉素(10 nmol·L-1)處理后5 h的HCEC細(xì)胞作為陽性對(duì)照，經(jīng)免疫熒光結(jié)果顯示，HCEC與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)(MOI=1:100)5 h后，細(xì)胞內(nèi)LC3表達(dá)顯著增加(圖1B)。因此選擇銅綠假單胞菌作用5 h用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 DHA誘導(dǎo)HCEC細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

經(jīng)Western Blot法檢測(cè)，隨著DHA作用濃度(10、20、40 μmol·L-1)的增加，LC3B-II/LC3B-I蛋白表達(dá)比值逐漸升高(空白組：0.01±0.00；DHA 10 μmol·L-1：0.12±0.02；DHA 20 μmol·L-1：0.30±0.06；DHA 40 μmol·L-1：0.58±0.10)，同時(shí)P62蛋白表達(dá)水平逐漸降低(空白組：0.89±0.10；DHA 10 μmol·L-1：0.77±0.12；DHA 20 μmol·L-1：0.50±0.06；DHA 40 μmol·L-1：0.18±0.04)，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2A)。此外，與空白組(0.01±0.00)相比，DHA組LC3B-II/LC3B-I蛋白表達(dá)比值(0.60±0.05)顯著升高，CQ組LC3B-II/LC3B-I蛋白表達(dá)比值(0.26±0.04)顯著降低(P<0.05)，而DHA+CQ共同處理導(dǎo)致LC3B-II/LC3B-I蛋白表達(dá)比值(0.50±0.02)顯著低于DHA組(P<0.05)，說明DHA 誘導(dǎo)的自噬是功能性的，而不是阻斷自噬通量而導(dǎo)致的LC3堆積，見圖2B。

2.3 DHA通過抑制NF-κB活性促進(jìn)HCEC細(xì)胞自噬

隨著DHA作用濃度(10、20、40 μmol·L-1)的增加，導(dǎo)致總蛋白中IκBα蛋白表達(dá)量以劑量依賴性方式顯著增加(空白組：0.33±0.03；DHA 10 μmol·L-1：0.15±0.03；DHA 20 μmol·L-1：0.36±0.04；DHA 40 μmol·L-1：0.88±0.07，P<0.05)，而p-IκBα蛋白表達(dá)量則顯著降低(空白組：0.95±0.08；DHA 10 μmol·L-1：0.40±0.02；DHA 20 μmol·L-1：0.27±0.02；DHA 40 μmol·L-1：0.08±0.01，P<0.05，見圖3A)。NF-κB激活需要RelA/p65亞基轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，因此本研究采用Western Blot法檢測(cè)了DHA對(duì)胞質(zhì)和胞核中RelA/p65分布的影響。結(jié)果表明，DHA處理有效地上調(diào)了細(xì)胞質(zhì)RelA/p65蛋白表達(dá)水平(空白組：0.22±0.01；DHA 10 μmol·L-1：0.30±0.03；DHA 20 μmol·L-1：0.47±0.05；DHA 40 μmol·L-1：0.69±0.06，P<0.05)并下調(diào)核RelA/p65蛋白表達(dá)水平(空白組：4.02±0.17；DHA 10 μmol·L-1：0.37±0.05；DHA 20 μmol·L-1：0.40±0.07；DHA 40 μmol·L-1：0.32±0.07，P<0.05，見圖3B)。然而在總細(xì)胞提取物中并沒有檢測(cè)到總RelA/p65蛋白水平的變化(空白組：1.80±0.22；DHA 10 μmol·L-1：1.78±0.25；DHA 20 μmol·L-1：1.69±0.22；DHA 40 μmol·L-1：1.65±0.18，P>0.05，見圖3A)，這表明DHA阻止了RelA/p65入核，而不是抑制RelA/p65蛋白合成。此外，為進(jìn)一步證實(shí)DHA通過抑制NF-κB活性以促進(jìn)HCEC細(xì)胞自噬，本研究用TNF-α(100 ng·mL-1)對(duì)HCEC細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果顯示，DHA(40 μmol·L-1)處理可顯著誘導(dǎo)HCEC細(xì)胞中LC3轉(zhuǎn)化，LC3B-II/LC3-I蛋白比值較空白組顯著增加(0.92±0.08比0.17±0.01，P<0.05)；而在DHA和TNF-α共同處理后，HCEC中LC3B-II/LC3-I蛋白比值則低于DHA組(0.40±0.05比0.92±0.08，P<0.05，見圖3C)。表明激活NF-κB可抑制DHA對(duì)角膜上皮細(xì)胞的自噬促進(jìn)作用。

A：總蛋白樣本中NF-κB(p65)蛋白、IκBα蛋白、p-IκBα(Ser32/36)蛋白表達(dá)；B：胞核和胞質(zhì)蛋白樣本NF-κB(p65)蛋白表達(dá)；C：總蛋白樣本中LC3蛋白表達(dá)。

2.4 各組小鼠角膜組織銅綠假單胞菌載菌量比較

在建模24 h后，檢測(cè)各組小鼠的角膜載菌量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組(0.75×106CFU)相比，CQ組和3-MA組小鼠角膜載菌量分別增加至(1.05±0.12)×106CFU和(0.98±0.12)×106CFU(P<0.05)；而雷帕霉素組和DHA組小鼠角膜載菌量分別為(0.78±0.09)×106CFU和(0.74±0.10)×106CFU，與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：CQ組；D：雷帕霉素組；E：3-MA組；F：DHA組。圖4 各組小鼠角膜組織銅綠假單胞菌載菌量比較

3 討論

目前，臨床上針對(duì)銅綠假單胞菌角膜炎的治療通常為經(jīng)驗(yàn)性治療，主要依賴廣譜抗生素，但其治療效果往往差強(qiáng)人意[10]。目前，青蒿素及其相關(guān)衍生物在眼科的應(yīng)用受到了日益增加的關(guān)注[7,11]。本研究旨在探討DHA在保護(hù)角膜免受銅綠假單胞菌感染中的作用，結(jié)果顯示DHA可以顯著降低銅綠假單胞菌角膜炎小鼠的角膜載菌量，同時(shí)體外HCEC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，DHA能夠增加熱滅活銅綠假單胞菌感染的角膜上皮細(xì)胞的總體自噬水平。說明DHA對(duì)于人角膜上皮細(xì)胞有一定的抗銅綠假單胞菌感染作用。

無血管的角膜組織具有2種特殊功能，即形成保護(hù)性屏障和作為視覺系統(tǒng)的主要屈光元件[3,6]。在正常情況下，角膜對(duì)感染有明顯的抵抗力。然而，當(dāng)上皮屏障被突破(通常發(fā)生在配戴隱形眼鏡期間)或免疫功能受損(如糖尿病患者)時(shí)，機(jī)會(huì)致病菌(如銅綠假單胞菌)便會(huì)進(jìn)入復(fù)層上皮，最終侵入基質(zhì)，引致感染性角膜炎，導(dǎo)致角膜渾濁。銅綠假單胞菌是引起細(xì)菌性角膜炎的革蘭氏陰性致病菌，特別是在長(zhǎng)時(shí)間接觸鏡片的隱形眼鏡使用者中十分常見，如果沒有得到及時(shí)和適當(dāng)?shù)闹委?，可能?huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視力下降甚至失明。銅綠假單胞菌已被證明可在多種細(xì)胞內(nèi)侵襲和復(fù)制，并合成多種有害外毒素。其中，外毒素S和T是具有腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)和谷胱甘肽酶激活蛋白活性的雙功能毒素；外毒素U是一種磷脂酶，能使宿主細(xì)胞迅速溶解；而外毒素Y是一種分泌型腺苷酸環(huán)化酶；Ⅲ型蛋白分泌與急性肺部感染等疾病死亡率有關(guān)。有研究[10]證實(shí)，在角膜炎中，外毒素S、T的ADPRT活性能夠介導(dǎo)對(duì)宿主免疫反應(yīng)的破壞，以促進(jìn)細(xì)菌的生存和角膜疾病的發(fā)展。自噬是一種正常的細(xì)胞分解代謝過程，特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)形成被稱為自噬體的雙膜細(xì)胞器，自噬體吞噬細(xì)胞質(zhì)成分在與溶酶體融合后被降解。自噬過程在清除細(xì)胞內(nèi)病原體中起主要作用[10,12]。然而，一些病原體會(huì)設(shè)法逃避自噬降解，甚至利用自噬過程為自身的復(fù)制提供幫助[13]。因此，自噬的最終效果往往對(duì)感染性疾病的預(yù)后具有重要的影響。銅綠假單胞菌已被證明可激活肺泡巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞中的自噬[14-15]。近些年也有研究[2]證實(shí)，銅綠假單胞菌可以激活角膜上皮細(xì)胞的自噬。本試驗(yàn)證明了角膜上皮細(xì)胞自噬對(duì)抵抗銅綠假單胞菌感染可以起到幫助作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DHA降低角膜載菌量的效果優(yōu)于雷帕霉素?？紤]到人類使用青蒿素這一中藥及其衍生物已有很長(zhǎng)時(shí)間，其生物安全性已得到了充分的證實(shí)，因此DHA有望作為治療銅綠假單胞菌角膜炎的輔助用藥。

NF-κB被廣泛認(rèn)為是腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑，因?yàn)樗哂幸种萍?xì)胞程序性死亡途徑的功能，可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡敏感性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[16-17]。NF-κB抗細(xì)胞凋亡功能所涉及機(jī)制的研究表明，它的激活可以保護(hù)細(xì)胞免受TNF-α和其他刺激物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18]。此外，角膜上皮細(xì)胞中一些抗凋亡基因，包括Bcl-2家族成員，已被證明可被NF-κB激活以及其他證據(jù)亦表明NF-κB還對(duì)p53的功能具有拮抗作用[19]。因此，NF-κB常被用作新型預(yù)防和治療疾病的靶點(diǎn)。而JEOK等[20]也證實(shí)銅綠假單胞菌基因DNAK可通過TLR4依賴的NF-κB信號(hào)通路刺激Pentraxin 3蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而觸發(fā)宿主的免疫防御反應(yīng)。WANG等[21]的研究表明，在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中DHA可以通過抑制NF-κB以促進(jìn)自噬。于是筆者提出假說：DHA通過抑制NF-κB以促進(jìn)HCEC細(xì)胞自噬，最終提升HCEC細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。

本研究證明了DHA通過提升角膜上皮細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)其對(duì)銅綠假單胞菌的清除作用；此外也進(jìn)一步揭示了DHA通過抑制RelA/p65核易位以及IκBα磷酸化和降解，導(dǎo)致NF-κB失活，進(jìn)而增強(qiáng)HCEC細(xì)胞的自噬活性，這可能是DHA促進(jìn)人角膜上皮細(xì)胞中銅綠假單胞菌清除的作用機(jī)制之一。以自噬為基礎(chǔ)的輔助療法有希望成為治療感染性角膜炎的方案之一，而本研究為DHA應(yīng)用于銅綠假單胞菌角膜炎的治療提供了理論基礎(chǔ)。然而該結(jié)論尚需要進(jìn)行體內(nèi)研究以闡明DHA的安全性和有效性。