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        奧美沙坦對(duì)高尿酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響及機(jī)制

        2022-05-30 03:26:58向啟蒙耿燕秋余燕燕劉秀娟
        關(guān)鍵詞:水平

        向啟蒙,耿燕秋,余燕燕,鄒 鑫,于 冰,劉秀娟

        (1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,南昌330004; 2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇八醫(yī)院腎內(nèi)科,南昌330002; 3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心腎內(nèi)科,北京100039)

        腎纖維化是多種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同病理過(guò)程,與腎臟功能損害程度密切相關(guān)[1-2]。血管緊張素是影響腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[3],多種血管緊張素受體拮抗劑例如纈沙坦、非馬沙坦等被報(bào)道具有抗腎纖維化作用[4-5]。有研究[6-7]發(fā)現(xiàn),血管緊張素受體拮抗劑奧美沙坦(OLM)具有腎臟保護(hù)作用,且能減少Alport綜合征模型小鼠的腎臟纖維化,但其具體的抗纖維化機(jī)制尚未完全明確。Toll樣受體4(TLR4)及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等可調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)纖連蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)等細(xì)胞外基質(zhì)的合成與積聚,促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[8-9]。有研究[10]表明,OLM可抑制載脂蛋白E基因缺失模型小鼠主動(dòng)脈中TLR4的表達(dá),但其是否影響腎纖維化過(guò)程中TLR4表達(dá)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積仍不清楚。本研究以腎小管上皮HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象,采用高尿酸誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞纖維化,體外探究OLM對(duì)高尿酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響及機(jī)制,以期為以腎纖維化為病理特征的慢性腎臟疾病提供新的治療策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞與主要試劑

        人近腎端小管上皮HK-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。OLM購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。尿酸購(gòu)自美國(guó)sigma公司。CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司。TRIzol試劑、LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PrimeScript TM RT reagent Kit試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。PCR引物、pcDNA3.1及TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TLR4均由上海吉瑪公司提供。E-cadherin、vimentin、α-SMA、TLR4、β-actin等的一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。CA1410活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。collagen Ⅰ、Fibronectin、白細(xì)胞介素(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測(cè)

        采用600 μmol·L-1的尿酸處理HK-2細(xì)胞體外誘導(dǎo)腎纖維化細(xì)胞模型。采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)傳代,取4~8代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用不同濃度的OLM(0、5、10、20 μmol·L-1)處理HK-2細(xì)胞,以2×105cells·mL-1的濃度,將各組細(xì)胞分別接種于96孔板,培養(yǎng)48 h后,按照CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒操作,每孔加入20 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

        將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為5組。1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞;2)高尿酸組:培養(yǎng)基中加入600 μmol·L-1的尿酸以誘導(dǎo)體外腎纖維化細(xì)胞模型;3)高尿酸+OLM組:培養(yǎng)基中加入600 μmol·L-1的尿酸和10 μmol·L-1的OLM;4)高尿酸+OLM+TLR4組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TLR4的HK-2細(xì)胞采用含有600 μmol·L-1的尿酸和10 μmol·L-1的OLM的培養(yǎng)基培養(yǎng);5)高尿酸+OLM+空載組:僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞采用含有600 μmol·L-1的尿酸和10 μmol·L-1的OLM的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

        1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

        以1×105cells·mL-1的濃度將各組HK-2細(xì)胞接種于96孔板,過(guò)夜培養(yǎng)以使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%左右。采用LipofectamineTM3000將pcDNA3.1-TLR4或pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,48 h后實(shí)時(shí)定量PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

        1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

        按照Trizol試劑盒的說(shuō)明操作,提取各組細(xì)胞的總RNA。經(jīng)過(guò)PrimeScript TM RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄后,采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。TLR4的引物序列為:上游5′-GATGTCAGGGAGGGGACTCT-3′,下游5′-TGCCAGAGCGGCTACTCAGA-3′。β-actin的引物序列為:上游5′-AGTGTGACGTTGACATCCGTA-3′,下游5′-GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT-3′。以β-actin為內(nèi)參,按照2-△△CT法計(jì)算TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)。

        1.2.5 western blot檢測(cè)

        采用RIPA裂解并提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每組取20 μg用10% SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。采用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h后,再將膜分別與抗E-cadherin、vimentin、α-SMA、TLR4、β-actin等一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。漂洗后,室溫下將膜與二抗孵育1 h,最后采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.2.6 細(xì)胞活性氧ROS檢測(cè)

        收集各組細(xì)胞,按照CA1410活性氧檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明操作,利用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平。

        1.2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥因子

        收集各組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作,檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)(collagen Ⅰ和Fibronectin)、促炎因子(IL-6、TNF-α)的水平。

        1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS22.0軟件和GraphPad Prism7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),2組間比較采用student’st檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 OLM對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響

        CCK-8結(jié)果顯示,濃度為5、10、20 μmol·L-1的OLM對(duì)HK-2細(xì)胞活力無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。后續(xù)選擇10 μmol·L-1的OLM處理細(xì)胞。

        △P>0.05與對(duì)照組比較。圖1 不同濃度OLM對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響

        2.2 OLM對(duì)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響

        與對(duì)照組相比,高尿酸組E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),而vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05),細(xì)胞上清中collagen Ⅰ和Fibronectin的水平均增加(P<0.05);與高尿酸組相比,高尿酸+OLM組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05),而vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平減少(P<0.05),細(xì)胞上清中collagen Ⅰ和Fibronectin水平減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

        *P<0.05與對(duì)照組比較;#P<0.05與高尿酸組比較。圖2 OLM對(duì)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)志物水平的影響

        2.3 OLM對(duì)TLR4表達(dá)及氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

        與對(duì)照組相比,高尿酸組細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)增加(P<0.05),ROS、IL-6、TNF-α水平均增加(P<0.05);與高尿酸組相比,高尿酸+OLM組細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)減少(P<0.05),ROS、IL-6、TNF-α水平均減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

        *P<0.05與對(duì)照組比較;#P<0.05與高尿酸組比較。圖3 OLM對(duì)TLR4蛋白表達(dá)、氧化應(yīng)激及炎癥因子水平的影響

        2.4 TLR4過(guò)表達(dá)的驗(yàn)證

        與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TLR4后,HK-2細(xì)胞TLR4的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),其蛋白表達(dá)水平也上調(diào)(P<0.05)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染空載體后,TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(均P>0.05)。見(jiàn)圖4。

        *P<0.05、△P>0.05與對(duì)照組比較。圖4 TLR4在HK-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的驗(yàn)證

        2.5 TLR4過(guò)表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化標(biāo)志物的影響

        與高尿酸+OLM組相比,高尿酸+OLM+TLR4組E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P<0.05),而vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)增加(P<0.05),細(xì)胞上清中collagen Ⅰ和Fibronectin水平也增加(P<0.05)。與高尿酸+OLM組相比,轉(zhuǎn)染空載體后,E-cadherin、vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化,細(xì)胞上清中collagen Ⅰ和Fibronectin水平也無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

        *P<0.05與對(duì)照組比較;#P<0.05與高尿酸組比較;&P<0.05、△P>0.05與高尿酸+OLM組比較。圖5 TLR4過(guò)表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化標(biāo)志物的影響

        3 討論

        細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積是腎臟纖維化的始動(dòng)因素和關(guān)鍵病變環(huán)節(jié),抑制細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度合成或促進(jìn)基質(zhì)降解等可減少細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積,抑制腎纖維化進(jìn)程[1]。腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞,而腎小管上皮細(xì)胞可通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得肌成纖維細(xì)胞的特性[2,11]。因此,抑制腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚重要方式。

        血管緊張素受體拮抗劑OLM可以抑制人結(jié)膜下Tenon’s囊成纖維細(xì)胞的增殖活性[12],并減少Alport綜合征模型小鼠的腎臟纖維化[7,13]。OLM的長(zhǎng)期治療可顯著改善UUO模型小鼠的腎纖維化,并引起腎纖維化標(biāo)志蛋白TGF-β1的表達(dá)降低[13]。本研究發(fā)現(xiàn)5、10、20 μmol·L-1濃度的OLM對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的增殖活性的影響均無(wú)顯著差異,本研究后續(xù)采用10 μmol·L-1的OLM研究其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

        高尿酸可誘導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展[14]。因此本研究采用高尿酸體外誘導(dǎo)腎小管上皮HK-2細(xì)胞的纖維化。與文獻(xiàn)[14]報(bào)道類似,本研究中高尿酸處理顯著減少上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá),增加間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA、vimentin表達(dá),同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)collagen Ⅰ和Fibronectin水平也顯著提高,表明高尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮HK-2細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增加其細(xì)胞外基質(zhì)積聚。然而,OLM明顯增加E-cadherin表達(dá),抑制α-SMA、vimentin表達(dá),并降低collagen Ⅰ和Fibronectin水平,提示OLM可抑制高尿酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚,進(jìn)而發(fā)揮其抗腎纖維化作用。這一發(fā)現(xiàn)與奧美沙坦酯可以減少腹膜透析模型大鼠間皮細(xì)胞損傷標(biāo)志分子α-SMA表達(dá),而增加E-cadherin表達(dá)一致[15],也與OLM可減少糖尿病腎病模型小鼠腎組織collagen-Ⅲ和Fibronectin表達(dá)[16],抑制其腎纖維化類似。

        TLR4及其介導(dǎo)氧化應(yīng)激和促炎反應(yīng)等可促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展[8,17],高尿酸可通過(guò)激活TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而敲低TLR4則能抑制高尿酸的促纖維化作用[14]。在載脂蛋白E基因缺失模型小鼠中,OLM處理可抑制其主動(dòng)脈中TLR4的表達(dá)[10]。既往研究[18]表明,口服OLM能減少潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠血清IL-6和TNF-α水平,并提高抗氧化相關(guān)分子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),OLM可抑制高尿酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞TLR4表達(dá),降低活性氧ROS水平,并減少促炎因子IL-6和TNF-α水平,表明OLM可抑制高尿酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中TLR4表達(dá)及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和促炎反應(yīng)。這與OLM可以減少腹膜透析模型大鼠血清IL-6和TNF-α炎癥因子水平,抑制其微炎癥狀態(tài)一致[15]。此外,TLR4過(guò)表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)OLM介導(dǎo)的E-cadherin高表達(dá)、α-SMA和vimentin的低表達(dá),增加細(xì)胞外基質(zhì)collagen Ⅰ和Fibronectin水平,提示OLM抑制TLR4發(fā)揮抗腎纖維化作用。

        綜上所述,OLM可通過(guò)抑制TLR4及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)抑制腎小管上皮HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚,進(jìn)而抑制腎纖維化。本研究為以腎纖維化為病理特征的慢性腎臟疾病的治療策略提供了新方向,也為OLM在慢性腎臟相關(guān)疾病的防治應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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