趙麗輝 孫世珺★ 易冰 曾玉梅

甲狀腺癌是內分泌器官最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高，不同組織學類型和亞型的甲狀腺癌具有不同的細胞來源、腫瘤特征和預后。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最常見，約占甲狀腺癌的85%～90%［1-2］。BRAF基因在多種惡性腫瘤中發(fā)生突變，研究證實，V600E 是BRAF突變最常見的突變位點，在PTC 中BRAFV600E 突變的發(fā)生率為40%～80%［3-5］。研究顯示BRAFV600E 與PTC 不良臨床病理結果有很強的相關性，如復發(fā)增加［6］、對放射性碘的攝取減弱及治療失敗等［7-8］。PTC 原發(fā)灶的BRAFV600E 基因突變與遠處轉移灶的攝碘能力下降有關［9］。甲狀腺細針穿刺細胞學檢查（fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）可在術前明確甲狀腺結節(jié)性質，為甲狀腺疾病個體化精準治療提供依據(jù)，是甲狀腺診治決策的關鍵，近幾年在廣東省甲狀腺腫瘤患者診斷中的運用較為廣泛。本研究探討B(tài)RAF基因突變在PTC早期診斷、治療策略選擇及預后判斷中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

分析自2017年11月至2020年10月于中山市人民醫(yī)院就診的甲狀腺結節(jié)患者601 例，均在B 超引導下行細針穿刺（FNA），穿刺新鮮細胞液給予細胞學診斷及BRAF基因檢測，檢測后保守治療344 例，手術治療257 例，手術后病理結果確診為惡性腫瘤212例，其中PTC 患者208 例，男性44 例，女性164 例，年齡平均（42.03±10.21）歲，甲狀腺濾泡性癌患者2 例，甲狀腺髓樣癌2例。良性病變45例，其中結節(jié)性甲狀腺腫40 例，濾泡腺瘤2 例，橋本甲狀腺炎2 例，透明變梁狀腫瘤1 例。納入標準：①術前有彩超記錄且評估結節(jié)為可疑惡性（TI-RAS 分類4 類及以上結節(jié)）；②術前行FNA 及穿刺液BRAF基因檢測；③行甲狀腺手術治療；④術后病理明確。排除標準：①多次手術患者；②非本院行FNA 及BRAF基因檢測；③病歷資料不完整。所有患者穿刺及術前均簽署知情同意書。本研究經過院倫理委員會批準同意。

1.2 試劑和方法

601 例甲狀腺結節(jié)患者均行BRAFV600E 基因檢測，檢測試劑為人類BRAF基因V600E 突變檢測試劑盒（廠家：廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；批號：11220070701X；規(guī)格：24 人份/盒），用于BRAF基因V600E 體細胞突變（即1799T＞A）檢測。PCR 使用擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法，RT-PCR 儀為上海宏石熒光定量PCR 儀（規(guī)格型號：SLAN-96S）。臨床醫(yī)師在超聲引導下，定位穿刺結節(jié)，用細針準確進行穿刺后，將穿刺出的新鮮細胞液一針注入液基保存瓶編號標記后送往病理科進行液基細胞學診斷，另一針注入預裝有200 μL DTL 裂解液的1.5 mL 離心管中，編號標記后送往分子診斷中心進行BRAF基因檢測。標本保存在4℃，不超過72 h。核酸提取采用FFPE DNA 核酸提取試劑（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司），并使用超微量紫外分光光度儀進行質控及濃度測定。PCR 上機時將樣品濃度稀釋至1 μg/L，濃度不足1 μg/L 的標本，DNA 按原濃度上機。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析；計數(shù)資料以n（%）表示，行卡方檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺結節(jié)術后患者BRAF V600E 基因突變情況

257 例患者中，術后病理結果確診為PTC 208例，BRAFV600E 基因突變型137 例，突變率為65.87%（137/208），野生型71 例，占34.13（71/208），甲狀腺其他類型癌（甲狀腺濾泡癌2 例，甲狀腺髓樣癌2 例）及甲狀腺良性病變（結節(jié)性甲狀腺腫40 例，濾泡腺瘤2 例，橋本甲狀腺炎2 例，透明變梁狀腫瘤1 例）均未檢測到BRAFV600E 基因突變，甲狀腺結節(jié)中，PTC 與其它癌變及良性病變BRAFV600E 基因突變比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 甲狀腺結節(jié)術后患者BRAF 基因突變的比較［n（%）］Table 1 Comparison of BRAF gene mutations in patients after thyroid nodule surgery［n（%）］

2.2 BRAF V600E 基因檢測與液基細胞學診斷結果

術后病理結果確診為惡性腫瘤的212 例中，BRAFV600E 基因突變陽性208 例（均為PTC），突變陰性4 例；術前FNAC 細胞學診斷結果為惡性腫瘤108 例，可疑惡性腫瘤76 例，濾泡性腫瘤2 例，非典型病變21 例，良性病變4 例，無法診斷1 例，病理結果為甲狀腺良性病變45 例，均為BRAFV600E 陰性，術前FNAC 細胞學診斷結果可疑惡性腫瘤19例，濾泡性腫瘤1 例，非典型病變11 例，良性病變12 例，無法診斷2 例。在病理確診的212 例甲狀腺癌中，F(xiàn)NAC 診斷為惡性腫瘤108 例，敏感性50.94%（108/212）；BRAFV600E 基因檢測突變陽性137 例，敏 感 性64.62%（137/212），F(xiàn)NAC+BRAFV600E 兩種診斷方法聯(lián)合檢測敏感性83.02%（176/212），聯(lián)合檢測使診斷的檢出率明顯提高。見表2。

表2 BRAF V600E基因檢測與液基細胞學（FNAC）診斷結果Table 2 BRAF V600E gene testing and fluid based cytology（FNAC）diagnosis results

2.3 甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E 基因突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關系

PTC 伴有鈣化灶患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于PTC 不伴有鈣化灶患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PTC 不伴有結節(jié)性甲狀腺腫的患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于PTC 伴有結節(jié)性甲狀腺腫患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），腫瘤最大直徑＜1.0 cm 的PTC 患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于最大直徑≥1.0 cm 的PTC 患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的PTC 患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的PTC 患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 甲狀腺乳頭狀癌BRAF 基因突變與臨床病理特征的關系［n（%）］Table 3 Relationship between BRAF gene mutation and clinicopathological features in papillary thyroid carcinoma［n（%）］

3 討論

超聲引導下的細針穿刺（fine-needle aspiration，F(xiàn)NA）是甲狀腺結節(jié)良惡性甄別的首選方法［10］，2017 版Bethesda 系統(tǒng)（TBSRTC），將甲狀腺細針穿刺后的病理學結果分為六類，并對每種分類提供了惡性風險判斷與臨床處理原則［11］。但細胞形態(tài)學的觀察范圍有限，仍有占比較大的Ⅲ至Ⅴ類結果不能定性。中國甲狀腺癌診療規(guī)范（2018年版）認為，經FNA 不能確定良惡性的甲狀腺結節(jié)，可對穿刺標本進行某些甲狀腺癌的分子標記物檢測［10］BRAF基因是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號通路最為關鍵的激活因子，參與調控細胞生長、分化和凋亡等［12］。BRAF突變主要有兩種類型：發(fā)生于exon11 上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等的點突變；發(fā)生在Exon15激活區(qū)，其中約90%位于第1 799 核苷酸上，T突變?yōu)锳（T1799A），導致其編碼的纈氨酸由谷氨酸取代。BRAFV600E 突變檢測在甲狀腺術前治療決策的影響不容忽視，突變狀態(tài)不僅可以提高細胞學惡性結節(jié)的診斷率，也為難治性甲狀腺癌的靶向藥物BRAFV600E 抑制劑（如威羅菲尼）治療提供病理依據(jù)［13］。研究顯示，BRAF基因在PTC 中的突變率可達60%～80%，在亞洲人群中，BRAF突變率甚至更高，BRAF在FTC 中較少突變，在良性結節(jié)罕見突變［14］。術前檢測BRAFV600E突變狀況，有助于PTC 的診斷和臨床預后預測，便于制定個體化的診治方案［10］。

本研究結果與既往研究報道數(shù)據(jù)基本相符，提示BRAFV600E 基因突變與PTC 密切相關。

Brown 等［15］研究認為，BRAF 基因檢測聯(lián)合FNA 細胞學檢查大幅提高了穿刺的敏感度。本研究結果顯示聯(lián)合檢測使診斷的敏感性由50.94%提高到83.02%，明顯提高了甲狀腺惡性結節(jié)的檢出率，因此，聯(lián)合FNAC 及BRAFV600E 基因突變檢測有助于PTC 的早期診斷。研究報道，BRAF基因突變假陽性非常低，F(xiàn)NA 細胞標本伴BRAF 突變可以高度懷疑惡性結節(jié)［10］。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)一例患者BRAFV600E 基因突變陽性，但術后病理結果為結節(jié)性甲狀腺腫，經再次廣泛取材，重新病檢結果為甲狀腺微小乳頭狀癌。因此，BRAFV600E 基因檢測結果對病理組織漏檢也有一定幫助。

Changlin Li 的最新報道證實，腫瘤組織鈣化與PTC 的侵襲性呈正相關［16］。本研究結果提示BRAF基因突變更易發(fā)生在腫瘤直徑小于1cm 的PTC 中，在伴有鈣化、不伴結節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E 基因突變率較高。慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（chroniclymphocytic thyroiditis，CLT）又稱伴橋本氏甲狀腺炎，是原發(fā)性甲狀腺功能減退癥最主要的原因。Ju-Han Lee 等［17］基于10648 例PTC 患者的薈萃分析顯示，PTC 與CLT 顯著相關，CLT 的合并率為23.2%，比合并良性甲狀腺結節(jié)性疾病高2.8 倍。本研究中，甲狀腺乳頭狀癌合并CLT 的比例為11.5%，低于文獻報道，但在兩組間BRAF基因突變率無明顯差異。因此，PTC 患者BRAFV600E 基因突變狀態(tài)與是否伴有鈣化灶、是否伴有結節(jié)性甲狀腺腫及腫瘤最大徑、TNM 分期相關，在伴有鈣化、腫瘤最大徑小于1.0 cm、不伴結節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E 基因突變率較高。BRAFV600E 基因突變狀態(tài)與PTC 患者年齡、性別、病理亞型、腫瘤穿刺部位、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎等無明顯相關。

綜上所述，本組研究中山市地區(qū)甲狀腺癌患者BRAFV600E 基因突變主要發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌患者中，其它組織學類型的甲狀腺癌BRAFV600E 基因突變率較低，PTC 患者女性發(fā)病率高于男性。BRAFV600E 基因突變更易發(fā)生在腫瘤直徑小于1 cm 的PTC 中，在伴有鈣化灶、不伴結節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的PTC 中BRAF基因突變率越高，預后越差。BRAFV600E 基因檢測結果對防止病理組織漏檢也有一定幫助，尤其是微小癌。聯(lián)合FNAC 及BRAF基因的檢測有助于PTC 的早期發(fā)現(xiàn)、早期診治和預后判斷。