牛婧 李嬌 李娜 孫婧 張靜 王亞文

細菌性陰道?。˙acterial vaginosis，BV）是由加德納菌、厭氧菌等增多，乳酸桿菌減少，陰道生態(tài)系統(tǒng)改變而引起的陰道感染性疾?。?］。BV 是育齡期女性中最常見的陰道感染性疾病之一［2］，有研究表明其感染率在20%～60%［3］，且BV 患者中約50%無臨床癥狀表現［4］。BV 可誘發(fā)多種婦科疾病，如尿道炎、其他類型的陰道炎、子宮內膜炎、婦科腫瘤［5］，也可導致多種產科疾病，如早產、羊膜炎、羊水感染、絨毛膜炎、新生兒感染等［6-7］。另外由于BV 與其他性傳播疾病，如人類免疫缺陷病毒、單傳皰疹病毒Ⅱ型、沙眼衣原體和淋病奈瑟菌的感染有關［8-9］，BV 已成為全球關注的主要問題。因此，對BV 早診斷、早治療對女性生殖道健康具有非常重要的意義。在診斷BV 的實驗室方法中以Nugent 革蘭染色評分方法作為診斷和療效觀察的金標準［10］。但Nugent 評分方法缺乏標準化的分析前條件，傳統(tǒng)方法為使用無菌陰道窺器暴露陰道，使用無菌棉拭子拭取陰道內側分泌物從左至右在載玻片上涂片后送檢。因為不同的操作者在陰道分泌物的采樣量、均勻性和涂布厚度均沒有質量控制，在沒有涂片標準要求下的采樣結果其差異非常大，嚴重影響了診斷其結果的一致性和準確性［11］。因此，本研究旨在建立Nugent 評分前的樣本采集與涂布的標準化質量規(guī)范，以提高BV 診斷的準確性，并對改良方法進行評價。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2018年5月至2018年8月在西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦科門診就診的10 例女性作為研究對象進行改良方法的建立實驗，233 例研究對象進行改良方法和傳統(tǒng)方法的比較和評價實驗。納入標準：①符合陰道微生態(tài)評價的臨床應用專家共識［12］；②就診24 h 內無性生活史、陰道上藥史、陰道灌洗史；③對本研究簽署知情同意書。排除標準：①月經期婦女；②合并精神疾病，不能判斷自身癥狀者。本研究經院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

分析天平（生產廠家：賽多利思；型號：BSA224S-SW；精密度0.000 1 g）、顯微鏡（生產廠家：奧林巴斯；型號：C31）、革蘭氏染色液（生產廠家：珠海貝索生物技術有限公司；批號：C210801；規(guī)格：龍膽紫液×250 mL、碘溶液×250 mL、脫色液×250 mL、沙黃溶液×250 mL）、量勺、一次性無菌棉拭子、載玻片、涂布棒。

1.3 Nugent 評分方法分析前技術改良方法的建立與評價

1.3.1 涂片范圍的設計

在（76×26）mm 的載玻片上分別選擇（10×10，20×20，20×30）mm，設計涂片范圍，并用劃線筆進行確定，選擇涂片面積大小易于涂布操作及鏡下觀察。

1.3.2 陰道分泌物取樣量的設計

①選取10 位患者，由醫(yī)生取足量的陰道分泌物，分別使用預制量勺取樣稱重，取樣量分別為半勺、一平勺、兩平勺，每個樣本同一體積取樣三次，分別使用分析天平進行稱重，計算均數（X）、標準差（SD）和變異系數（CV），測算取樣最佳重量。②使用涂布棒，分別將這30 個樣本按三種體積、三種面積，在載玻片上進行均勻涂片。③將這30 個樣本進行革蘭染色后在顯微鏡油鏡下進行觀察，認為鏡下細菌分布均勻無聚集時為涂片薄厚合適，選擇薄厚合適的取樣量作為改良方法的陰道分泌物取樣量。

1.4 改良方法與傳統(tǒng)方法的比較

1.4.1 比較結果判讀方法

233 例研究對象分別使用傳統(tǒng)方法（將陰道分泌物從左至右進行涂片）及改良方法（采用標準的涂片量及標準的涂片范圍進行涂片），鏡下分別觀察菌群密集度、多樣性、Nugent 評分結果及BV 診斷結果并記錄，比較兩組結果的差異性。分別對傳統(tǒng)方法和改良方法的菌群密集度和菌群多樣性的鏡檢結果進行數值化，以“+”為1、“++”為2、“+++”為3、“++++”為4 進行量化值計算，對兩種方法的BV 診斷結果進行數值化，以“BV 陰性”為0，“中間型BV”為1，“BV 陽性”為2 進行量化值計算，分別計算同一患者樣本采用兩種方法檢測結果的差異，差異結果為傳統(tǒng)方法量化值減去改良方法量化值，差異≠0 即為有差異，差異率為（差值≠0 的樣本例數/總檢測例數）×100%。兩種方法的Nugent 評分差異結果為傳統(tǒng)方法的評分減去改良方法的評分，差異≠0 即為有差異，差異率為（差值≠0 的樣本例數/總檢測例數）×100%［12］。

1.4.2 染色結果判讀方法

按照2016年中華醫(yī)學會婦產科分會發(fā)布的陰道微生態(tài)評價的臨床應用專家共識［12］及2021年細菌性陰道病診治指南［13］中革蘭染色Nugent 評分標準，對菌群密集度、多樣性進行標準化評價以及BV的診斷。Nugent 評分以BV 陽性（細菌性陰道?。骸? 分；中間型BV：4～6 分；BV 陰性（正常）：0～3 分。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數據處理；計數資料以n（%）描述，方法間進行配對卡方檢驗；方法評價采用受試者工作特征（ROC）曲線；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 改良方法建立結果

涂片范圍為20 mm×20 mm 時涂片面積大小合適，易于涂布以及鏡下觀察，最終涂片范圍選擇20 mm×20 mm 的面積進行定量涂布。陰道分泌物在20 mm×20 mm 范圍內均勻涂片，半勺取樣量鏡下菌量較少稀薄，菌群分步少，易漏診和錯誤判讀，見圖1A；二平勺取樣量鏡下菌群聚集成團，不易于觀察計數，見圖1C；一平勺取樣量鏡下菌群分布均勻，無聚集成團的現象，見圖1B；最終選擇分泌物取樣量一平勺，即0.01 g。改良方案最終確定為：取0.01 g陰道分泌物，在載玻片上20 mm×20 mm 范圍內進行均勻涂片，染色后進行后續(xù)觀察和Nugent 評分。

圖1 陰道分泌物不同取樣量在20 mm×20 mm 面積下涂片革蘭染色結果（革蘭染色，×1 000）Figure 1 Gram staining results of smear under different sampling quantities of vaginal secretions at 20 mm×20 mm area（Gram staining，×1 000）

2.2 改良方法與傳統(tǒng)方法對菌群密集度差異分析

傳統(tǒng)方法與改良方法的菌群密集度結果見表1。兩種方法的差異率為56.2%（131/233），改良方法與傳統(tǒng)方法密集度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 傳統(tǒng)方法與改良方法菌群密集度結果［n（%）］Table 1 Results of flora density of traditional and improved methods［n（%）］

表2 傳統(tǒng)方法與改良方法密集度差異結果［n（%）］Table 2 Results of the difference in density between the traditional method and the improved method［n（%）］

2.3 改良方法與傳統(tǒng)方法對菌群多樣性分析

傳統(tǒng)方法與改良方法的菌群多樣性結果，見表3。改良方法與傳統(tǒng)方法多樣性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表3 傳統(tǒng)方法與改良方法菌群多樣性結果［（n%）］Table 3 Results of flora diversity of traditional and improved methods［（n%）］

表4 傳統(tǒng)方法與改良方法多樣性差異結果［n（%）］Table 4 Diversity differences between traditional methods and improved methods［n（%）］

2.4 Nugent 評分結果差異分析

兩種方法的Nugent 評分結果，見表5。改良方法與傳統(tǒng)方法Nugent 評分結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表6、圖2。

表5 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分結果［n（%）］Table 5 Nugent score results of traditional and improved methods［n（%）］

表6 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分差異結果［n（%）］Table 6 Difference results between traditional method and improved method Nugent score［n（%）］

圖2 傳統(tǒng)方法與改良方法的Nugent 評分差Figure 2 Nugent score difference between traditional and improved methods

2.3 改良方法與傳統(tǒng)對233 例患者細菌性陰道病診斷結果的比較

改良方法與傳統(tǒng)方法對BV 的診斷結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表7。

表7 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分診斷BV 結果［n（%）］Table 7 Traditional and improved methods Nugent score in the diagnosis of BV［n（%）］

2.4 傳統(tǒng)方法與改良方法的方法學評價

兩種方法的方法學評價結果顯示，改良方法（AUC 0.696）優(yōu)于傳統(tǒng)方法（AUC 0.662）。見表8、圖3。

圖3 傳統(tǒng)方法與改良方法的ROC 曲線Figure 3 ROC curves of traditional and improved methods

表8 傳統(tǒng)方法與改良方法的方法學評價結果Table 8 Methodological evaluation results of traditional and improved methods

3 討論

Nugent 評分標準是目前臨床診斷中診斷BV的一種重要方法。但Nugent 評分標準缺乏標準化的分析前條件，因為不同的取樣工具和程序導致陰道分泌物標本的均勻性和涂片厚度不同，這些差異都將影響其結果的解釋［11］。因此，在進行Nugent評分時應有定量化的規(guī)范操作，才能實現質量控制。本研究針對Nugent 評分方法的分析前處理進行標準化的制定及操作，用制定的改良方法涂片后在鏡下觀察菌群密集度、多樣性以及進行Nugent評分，并將結果與傳統(tǒng)方法涂片后的相關結果進行比較分析，結果都具有統(tǒng)計學差異。并以醫(yī)生診斷為陰道炎作為標準，比較兩種方法診斷結果的準確性，并對兩種方法進行方法學評價，得出結果：改良方法對BV 的診斷結果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

本研究的局限性在于改良方法并非絕對定量化，由于采樣工具以及涂片工具為自我研制，采樣量無法精準定量仍可導致部分誤差。在今后的工作中，需要進一步制定商業(yè)化的采樣工具采樣涂片為Nugent 評分方法分析前處理提供可推廣的支持，改良方法得以推廣應用于診斷BV 的工作中。

綜上所述，本研究認為建立分析前操作規(guī)范及定量采樣，規(guī)定面積下涂布，是對Nugent 評分標準在診斷細菌性陰道病的準確性的前提條件，改良方法的建立和使用可提高BV 診斷的準確性。