厲張金，王婕，樂(lè)婷，馬海潔

我國(guó)肝癌的發(fā)病率和病死率較高，5 年生存率＜5%，其中高轉(zhuǎn)移率是患者預(yù)后不良的最重要原因之一[1]。B7 家族是最重要的共刺激分子，其中B7 同源物1（B7H1）可與活化T細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡因子-1（PD-1）結(jié)合，抑制T 細(xì)胞受體（T-TCR）介導(dǎo)的T 細(xì)胞活化，在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮極其重要的作用[2]。細(xì)胞程序性死亡配體1（PD-L1）和CD276 分別是B7H1 和B7H3 家族中最重要的兩個(gè)成員之一。細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）可與B7 分子結(jié)合，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)，為重要的免疫卡控點(diǎn)。本研究擬探討PD-L1、CTLA-4及CD276 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 84 例肝癌組織樣本購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，組織芯片編號(hào)為HLivH090Su01。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）接受原發(fā)性肝癌切除手術(shù)患者；（2）病理診斷為肝癌，具有完整的臨床病理資料；（3）肉眼辨認(rèn)腫瘤病灶直徑＞1 cm；（4）患者術(shù)前未接受過(guò)放化療、分子靶向治療及免疫治療。其中男75 例，女9 例；年齡31～78 歲，平均（52.3±10.7）歲；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟的AJCC分期（第七版）為Ⅰ期55 例，Ⅱ～Ⅲ期29 例；腫瘤直徑＞5 cm 26 例，≤5 cm 58 例；所有組織均經(jīng)過(guò)10%甲醛固定、石蠟包埋。

1.2 觀察指標(biāo)（1）患者基本資料：年齡及性別；（2）肝癌組織病理資料：病理分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜是否完整及T/AJCC 臨床分期等指標(biāo)；（3）患者病理資料：肝硬化、血液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）、丙型肝炎病毒（HCV）抗體、總膽紅素（TB）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及甲胎蛋白（AFP）含量等指標(biāo)；（4）免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1、CTLA-4、CD276、CD4 及CD8 蛋白的表達(dá)情況。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 肝癌石蠟包埋組織塊制成后，連續(xù)切片約4 m厚度，HE 染色，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后，采用二步法染色檢測(cè) PD-L1、CTLA-4、CD276、CD4 及CD8 蛋白表達(dá)。一抗均來(lái)自河南賽諾特生物公司（貨號(hào)分別是C12A19、G219-1129、GM024 和EP51），陰性對(duì)照則用PBS 磷酸緩沖液替代一抗。所用二抗是DAKO EnVisionTM 二步法抗兔、鼠通用型免疫組化試劑。將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木素中染色30 s完成細(xì)胞核復(fù)染。最后脫水后，完成封片。

1.4 結(jié)果判定 染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，深褐色為4 分。陽(yáng)性范圍：隨機(jī)觀察5 個(gè)中倍視野（10×20），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞，將各個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均百分比作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分比；0 為0 分，＜1%為1 分，1%～10%為2 分，11%～33%為3 分，34%～66%為4 分，＞66%為5 分。上述兩項(xiàng)結(jié)果相乘，0～5 分定義為該基因低表達(dá)，6～12 分定義為該基因高表達(dá)。判定過(guò)程由2 名以上具有認(rèn)證資質(zhì)的病理科醫(yī)生通過(guò)雙盲法獨(dú)立進(jìn)行，有異議的病例則提交上級(jí)醫(yī)師進(jìn)行重新判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)利用SPSS 15.0 軟件及GraphPad Prism 5.0 軟件分析，所有數(shù)據(jù)均用方差同質(zhì)性檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1及CTLA-4表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 84 例標(biāo)本中，PD-L1高表達(dá)33 例，低表達(dá)51 例；CTLA-4 高表達(dá)15 例，CTLA-4 低表達(dá)69 例。PDL1 高表達(dá)組肝硬化陽(yáng)性例數(shù)、ALT≤40 U/L 例數(shù)占比均高于PD-L1 低表達(dá)組（均P ＜0.05）。PD-L1 表達(dá)水平與其余臨床病理特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。CTLA-4 表達(dá)水平在不同的臨床病理特征中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 肝癌臨床病理特征與PD-L1、CTLA-4 分子表達(dá)的關(guān)系 例（%）

2.2 CD276 表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系 84 例標(biāo)本中，CD276 高表達(dá)40 例，CD276 低表達(dá)44 例。兩組AFP＜100 g/L例數(shù)占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），其他肝癌臨床病理特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 肝癌臨床病理特征與CD276 分子表達(dá)的關(guān)系 例（%）

3 討論

近年來(lái)，癌癥免疫治療成為研究熱點(diǎn)，特別是免疫卡控點(diǎn)抑制劑（ICIs）已經(jīng)證明在肝癌中具有顯著的抗腫瘤活性和可控制的耐受性。針對(duì)PD-1、PD-L1 和CTLA-4 的抗體可以阻斷免疫卡控點(diǎn)[3]，通過(guò)恢復(fù)耗竭T 細(xì)胞以增強(qiáng)腫瘤免疫力。目前，聯(lián)合使用ICIs、分子靶向藥物，全身治療或局部治療的聯(lián)合治療策略已在多種類(lèi)型癌癥的臨床前和臨床研究中充分證實(shí)有效，但大多數(shù)肝癌患者并未從中受益。本研究將 PD-L1、CTLA-4 和CD276 聯(lián)合作為研究對(duì)象，研究其在肝癌組織中的表達(dá)水平，以期為肝癌免疫聯(lián)合治療方案提供依據(jù)。

研究表明，T細(xì)胞活化與增殖依賴(lài)于雙信號(hào)：一是抗原遞呈細(xì)胞（APC）遞呈的抗原肽-人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）復(fù)合物，由特殊T 細(xì)胞抗原受體（TCR 識(shí)別），并將信號(hào)傳遞給T 細(xì)胞，這是T 細(xì)胞活化必需的，但不引起T 細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子；二是共刺激信號(hào)（co-stimulatingsignal，第二信號(hào)），共刺激信號(hào)是T 細(xì)胞抗原特異性激活必需的，啟動(dòng)、維持并調(diào)節(jié)活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，決定了T 細(xì)胞是活化增殖，或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。

B7 家族是最重要的共刺激分子，是一類(lèi)屬于IgSF 具有高度同源性的基因，為跨膜蛋白，基本成員有B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2 和B7-H3 等。B7 家族成員表達(dá)后形成單鏈糖蛋白，大都存在于細(xì)胞壁上，分布于人體絕大部位的抗原遞呈細(xì)胞，在腫瘤免疫中作為第二信號(hào)，起著至關(guān)重要的作用。B7H1 與活化T 細(xì)胞表面表達(dá)的PD-1 結(jié)合后，抑制T-TCR 介導(dǎo)的T細(xì)胞活化[4]，導(dǎo)致活化T細(xì)胞的凋亡，在協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)殺傷中起著極其重要作用[5]。B7H3 是316 個(gè)氨基酸組成的I 型跨膜糖蛋白，最初是通過(guò)對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的cDNA 庫(kù)進(jìn)行核酸序列分析得到的B7 家族同源基因，屬于免疫球蛋白超家族。PD-L1 和CD276 分別是B7H1 和B7H3 家族中最重要的兩個(gè)成員之一[6]，在不同癌癥中均高表達(dá)。

CTLA-4 又名CD152，是一種白細(xì)胞分化抗原，是T 細(xì)胞上的一種跨膜受體[7]，與CD28 共同享有B7 分子配體，而CTLA-4 與B7 分子結(jié)合后誘導(dǎo)T 細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)?；蛑亟M的CTLA-4 Ig 可在體內(nèi)外有效、特異地抑制細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對(duì)移植排斥反應(yīng)及各種自身免疫性疾病有顯著的治療作用，毒副反應(yīng)極低，是目前被認(rèn)為較有希望的新的免疫抑制藥物。本研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中，PD-L1 表達(dá)水平與肝硬化陽(yáng)性率及ALT 表達(dá)水平有關(guān)，CD276 表達(dá)水平與患者血清中AFP 含量有關(guān)。這表明PD-L1 及CD276與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為潛在的肝細(xì)胞癌免疫治療的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。