童晶濤，張三典，賀婷婷，鄭璐，楊梓汝，許權(quán)，章慧

免疫治療在多種腫瘤中取得了顯著 的療效，其中包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。腫瘤組織中的PD-L1 表達(dá)水平是目前免疫治療的重要預(yù)測(cè)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1不僅存在于腫瘤細(xì)胞膜表面，還存在于細(xì)胞外，主要包括可溶型PD-L1（sPD-L1）和外泌體PD-L1（ePDL1）[1]。本研究檢測(cè)分析NSCLC 患者血清中ePD-L1 的陽(yáng)性表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探索其在不同特征NSCLC患者中的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年12 月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院放療科和呼吸科收住的經(jīng)病理確診的NSCLC 肺癌患者82 例，男62 例，女20例。收集同期20 例健康人血清樣本。記錄所有研究對(duì)象的臨床資料，包括患者性別、年齡、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型等。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的提取 用EDTA管采集全血，用1900 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中。離心機(jī)4 ℃預(yù)冷，3000 r/min 離心15 min，棄沉淀。將上清液移至新的離心管內(nèi)，2000 r/min離心30 min。取上清，4℃，10000 r/min 離心45min。將上清置于0.45 m 濾膜過(guò)濾，后4 ℃，100000r/min 離心70min。取沉淀用10 ml PBS 重懸，再次4℃，100000r/min 超速離心70min，得到外泌體沉淀物。去上清后用150 l預(yù)冷的PBS重懸，－80℃保存。

1.2.2 外泌體的鑒定 取外泌體10 l，銅網(wǎng)上沉淀1 min，加醋酸雙氧鈾10 l沉淀1 min，濾紙吸凈殘余液體。常溫干燥數(shù)分鐘后進(jìn)行電鏡檢測(cè)。

1.2.3 外泌體徑粒檢測(cè) 將外泌體取出20 l，加入980 lPBS 中并充分混勻。1ml注射器吸取所有液體加入馬爾文儀器加樣槽，設(shè)置好樣本名稱及稀釋度后進(jìn)行NTA 檢測(cè)。最終測(cè)得粒子濃度為50 倍稀釋后的濃度。

1.2.4 外泌體總蛋白提取 將外泌體與6×RIPA裂解液混勻，冰上裂解30min。取5 l 樣品加入到BCA 試劑中混勻，37 ℃孵育30 min。上機(jī)測(cè)量，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀吸光度值為562 nm 處，測(cè)量吸光度值，計(jì)算蛋白濃度。

1.2.5 Western-Blot 檢測(cè)外泌體中PDL1 的表達(dá) 配制濃度12%SDSPAG電泳膠；將電泳裝置裝好后，加入適量電泳緩沖液。取出蛋白樣品，進(jìn)行上樣。采用濕轉(zhuǎn)方式，300mA 轉(zhuǎn)膜60min，5%脫脂牛奶室溫下?lián)u床封閉1 h。將配制好的一抗溶液（抗體稀釋比例均為1∶1000）加入抗體盒中，4 ℃孵育過(guò)夜?；厥找豢购笥肨BST洗3 次，再進(jìn)行牛奶封閉3 次。加入按1∶5000 配在5%脫脂牛奶PBS 溶液中的二抗溶液，室溫?fù)u床孵育1 h?；厥斩购笥肨BST 室溫下洗膜3 次。用等體積混合的ECL A/B 液混合液浸泡PVDF膜，按照規(guī)范，設(shè)置好參數(shù)，進(jìn)行曝光。

1.2.6 ELISA 法檢測(cè)外泌體中PD-L1表達(dá)量 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)ePD-L1，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Raybiotech 公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，每份樣本重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者血清中外泌體鑒定透射電鏡下外泌體的形態(tài)呈明顯的茶托狀，納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示外泌體粒子直徑范圍在131 nm左右，呈現(xiàn)正態(tài)性分布。見(jiàn)圖1。

圖1 NSCLC 患者血清中外泌體

2.2 NSCLC 患者與健康人群血清中ePD-L1 蛋白的表達(dá)差異 NSCLC患者血清中ePD-L1 蛋白表達(dá)較健康人群對(duì)照組明顯增高，外泌體標(biāo)記物CD9 在兩組中的表達(dá)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 NSCLC 患者血清中的外泌體ePD-L1 表達(dá)

2.3 NSCLC 患者與健康人群血清中ePD-L1 的表達(dá)差異 NSCLC患者血清中ePD-L1 表達(dá)濃度較健康人群明顯增高，見(jiàn)圖3。以ePD-L1 與外泌體總蛋白的比值作為校正濃度（ePD-L1/pro），結(jié)果顯示NSCLC 患者血清中ePD-L1/pro 較健康人群明顯增高，見(jiàn)圖4。

圖3 NSCLC 患者血清中的ePD-L1 表達(dá)量

圖4 NSCLC 患者血清中的ePD-L1/pro

2.4 血清外泌體PD-L1 表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 血清e(cuò)PD-L1表達(dá)在性別、病理類型上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；但在年齡、吸煙、腫瘤大?。═ 分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M 分期）及腫瘤INM 分期中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。血清e(cuò)PD-L1/pro 表達(dá)在年齡、性別、病理類型及吸煙上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）；在T 分期、N 分期、M 分期及腫瘤INM 分期中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 血清e(cuò)PD-L1 表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

外泌體是細(xì)胞分泌的一種微小的膜性囊泡物質(zhì)，直徑50～150 nm，密度介于1.12～1.19 g/ml，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，通過(guò)胞吞進(jìn)入臨近細(xì)胞，釋放其中的DNA、miRNA及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，在細(xì)胞之間進(jìn)行信息傳遞，繼而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及遷移等多種生物學(xué)活動(dòng)[2-3]。而PD-L1 作為目前免疫治療的重要靶點(diǎn)，通常表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜，與T 細(xì)胞膜上的PD-1 相結(jié)合，激活PD-1/PD-L1 的抑制信號(hào)通路，抑制T細(xì)胞的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞除了在胞膜上表達(dá)PD-L1 外，還能釋放含有PD-L1 的外泌體，如惡性黑色素瘤、頭頸部腫瘤、乳腺癌及腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了ePD-L1 的表達(dá)[1，5-7]。ePDL1 相對(duì)于細(xì)胞膜PD-L1 更穩(wěn)定，不易被蛋白水解酶降解[8]，因此在誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制的微環(huán)境和生物功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮了重要作用，有望成為腫瘤臨床治療的新靶點(diǎn)[9]。

本研究結(jié)果顯示透射電鏡下外泌體呈明顯的茶托狀，粒子直徑范圍在131nm左右，呈現(xiàn)正態(tài)性分布，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道類似。本研究還發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者和健康對(duì)照者血清中ePD-L1 的表達(dá)差異明顯，腫瘤患者血清中ePD-L1 的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照者。同時(shí)，ELISA 定量分析結(jié)果顯示腫瘤患者血清中ePD-L1 的表達(dá)濃度明顯高于健康對(duì)照者。為了更精準(zhǔn)地顯示兩者的差異，本研究設(shè)定了ePD-L1與外泌體總蛋白比值作為校正濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的ePD-L1/pro 也明顯高于健康對(duì)照者，進(jìn)一步提示兩類人群中ePD-L1 的表達(dá)差異。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中ePD-L1 及ePD-L1/pro 表達(dá)濃度在T 分期、N 分期、M 分期及腫瘤TNM 分期中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），這表明ePD-L1 的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。這結(jié)果與文獻(xiàn)[11-13]類似，提示ePD-L1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中同樣有著重要的作用。