龍俊君 李蘭 曹倩 李云川 李勇 田二苗

(昆明市第一人民醫(yī)院眼科 昆明 650000)

當下角膜供體嚴重缺乏，在我國約400萬等待角膜移植的患者，而每年僅1萬余人進行手術[1]。在角膜供體如此缺乏的情況下，規(guī)范眼庫管理為臨床提供更多優(yōu)質(zhì)的角膜植片尤為重要。2016年，美國從62家眼庫收集了69 049名捐贈者捐贈的136 318枚眼角膜，卻有近26%的捐贈角膜通過評估后被認為不適合移植[2]。

供體角膜評估主要包括角膜內(nèi)皮細胞活性、微生物污染控制以及免疫原性[3]，角膜內(nèi)皮細胞活性是評價供體質(zhì)量的重要因素。在我們植片獲取和保存過程中易受環(huán)境等因素的制約，因此不同國家和地區(qū)的獲取標準不盡相同[4-6]。關于供體角膜內(nèi)皮細胞影響因素的研究目前仍沒有定論，而角膜內(nèi)皮細胞密度隨死亡-獲取時間、年齡等多種相關因素的變化規(guī)律有待進一步闡明。本文對116枚供體角膜進行內(nèi)皮細胞密度監(jiān)測，探究在獲取過程中影響角膜內(nèi)皮細胞密度的因素，以期為優(yōu)化角膜取材及保存的流程提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2019年1月~2021年1月于本院獲取的供體角膜植片132枚，符合標準116枚(87.8%)，16枚排除(12.1%)。其中8枚(6.0%)因角膜潰瘍排除，6枚(4.5%)因患有傳染性疾病排除，1枚(0.7%)因既往內(nèi)眼手術史排除，1枚(0.7%)因既往青光眼病史排除，余116枚角膜供體納入研究。

1.2 試劑與儀器 試劑：Eusol-C中期保存液、Ⅲ型安爾碘溶液。器材：內(nèi)皮顯微鏡(EB-3000 XYZ型，HAI公司，美國)、角膜剪、開瞼器、持針器、手術刀。分析軟件：內(nèi)皮分析軟件(CASEB 2.20，HAI公司，美國)。

1.3 研究方法

1.3.1 獲取角膜組織(原位角膜切除) ①消毒鋪巾，Ⅲ型安爾碘溶液沖洗結(jié)膜囊；②角膜剪沿角鞏膜緣剪開結(jié)膜囊，分離結(jié)膜下組織，手術刀于角鞏膜緣后3 mm處切開鞏膜，直達色素膜，角膜剪360°剪開鞏膜，取下角膜植片，保存于4 ℃，Eusol-C中期保存液中，內(nèi)皮面朝上；③置塑料透明角膜片于眼表創(chuàng)面，閉合瞼緣，恢復儀容。

1.3.2 檢測方法 ①參照《眼庫管理中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準》[3]，制訂角膜組織報告表。記錄供體編號、性別、年齡、死亡原因、死亡-獲取時間，取材后立即進行保存并由同一名醫(yī)師進行內(nèi)皮細胞密度的檢測。②裂隙燈顯微鏡檢查：角膜上皮層均完整；基質(zhì)層無水腫、瘢痕；后彈力層無褶皺。③內(nèi)皮細胞密度檢測：將裝有供體角膜植片的保存液瓶裝入內(nèi)皮顯微鏡的固定槽中，調(diào)節(jié)鏡頭的位置找到中央角膜，調(diào)整粗準焦螺旋找到角膜內(nèi)皮層，進一步調(diào)整細準焦螺旋使得內(nèi)皮細胞成像清晰，拍攝內(nèi)皮細胞圖，選擇其中的50~100個細胞，運用CASEB 2.20 內(nèi)皮分析軟件對所拍攝的圖片進行內(nèi)皮密度分析，對同一角膜植片重復測量3次取平均值，記錄數(shù)據(jù)。取材及檢測均由同一醫(yī)師進行。

1.4 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 23.0軟件將所收集數(shù)據(jù)整理后進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用頻數(shù)或率表示。滿足正態(tài)分布與方差齊性的資料采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，不滿足的資料則采用秩和檢驗。運用多元線性回歸分析研究死亡-獲取時間與角膜內(nèi)皮細胞密度的變化規(guī)律。以P＜0.05判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 供體年齡與角膜內(nèi)皮細胞相關性 116枚角膜供體中，年齡為(35.46±12.55)歲，按年齡將所測量的供體植片進行分組(表1)。其中＜30歲組，48例，平均角膜內(nèi)皮細胞密度為(3 151.770±347.288)個/mm2；＞30歲組，68例，平均角膜內(nèi)皮細胞密度為(2 846.338±338.867)個/mm2。不同年齡的供體角膜內(nèi)皮細胞密度差異有統(tǒng)計學意義(F=22.395，P＜0.001)。

2.2 供體死亡原因與角膜內(nèi)皮細胞相關性 本研究中供體因外傷死亡的有86例，余30例死于心腦血管意外(表1)。2組不同死亡原因的供體角膜內(nèi)皮細胞密度差異無統(tǒng)計學意義(F=1.444，P=0.232)。

2.3 供體死亡-獲取時間與角膜內(nèi)皮細胞相關性

2.3.1 供體死亡-獲取時間與角膜內(nèi)皮細胞密度 將116例角膜供體按死亡-獲取時間分組(圖1)，0~2 h組，40例，平均角膜內(nèi)皮細胞密度為(3 179.975±335.365)個/ mm2；2~4 h組，42例，平均角膜內(nèi)皮細胞密度為(2 962.595±355.271)個/ mm2；4~6 h組，34例，平均角膜內(nèi)皮細胞密度為(2 741.411±295.646)個/mm2。隨死亡-獲取時間延長所拍攝圖片角膜內(nèi)皮細胞清晰程度下降，圖C中因角膜水腫無法拍攝出清晰的圖像，而圖D中出現(xiàn)了無內(nèi)皮細胞區(qū)。116枚供體角膜內(nèi)皮細胞密度均＞2 000個/mm2。

圖1 不同死亡-獲取時間供體植片角膜內(nèi)皮細胞拍攝圖片 A.死亡-獲取時間為0.5 h，角膜內(nèi)皮細胞密度為3 701 個/mm2；B.死亡-獲取時間為2.25 h，角膜內(nèi)皮細胞密度為3 190 個/mm2；C.死亡-獲取時間5.2 h，角膜內(nèi)皮細胞密度為2 806 個/mm2，角膜植片部分出現(xiàn)水腫，所測角膜內(nèi)皮細胞圖像清晰度下降；D.死亡-獲取時間為5.5 h，角膜內(nèi)皮細胞密度為2 033 個/mm2，該植片出現(xiàn)了無內(nèi)皮細胞區(qū)。D 所拍攝位置非角膜中央，所測角膜內(nèi)皮細胞密度為中央角膜內(nèi)皮細胞密度。

表1顯示不同供體死亡-獲取時間的角膜內(nèi)皮細胞密度。不同死亡-獲取時間的角膜內(nèi)皮細胞密度差異有統(tǒng)計學意義(F=16.078，P=0.005)。運用SNK法進行事后檢驗；對不同死亡-獲取時間組間供體角膜內(nèi)皮細胞密度差值進行兩兩對比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 角膜植片內(nèi)皮細胞密度

2.3.2 供體死亡-獲取時間與角膜內(nèi)皮細胞六角形細胞占比及變異系數(shù) 不同死亡-獲取時間的供體角膜內(nèi)皮細胞六角形細胞占比及變異系數(shù)見表2。將3組數(shù)據(jù)的六角形細胞占比進行ANOVA，結(jié)果示不同死亡-獲取時間的六角形細胞占比差異有統(tǒng)計學意義(F=4.708，P=0.011)。運用LSD法進行事后檢驗：對不同死亡-獲取時間組間供體角膜內(nèi)皮細胞六角形細胞占比進行兩兩對比，0~2 h、2~4 h分別與4~6 h組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而0~2 h與2~4 h組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。將3組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)進行ANOVA，結(jié)果示不同死亡-獲取時間的變異系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(F=3.495，P=0.563)。

表2 角膜內(nèi)皮細胞六角形細胞占比及變異系數(shù)

2.4 角膜內(nèi)皮細胞密度隨死亡-獲取時間的變化規(guī)律 通過之前分析進行因變量的篩選，發(fā)現(xiàn)供體年齡、不同死亡-獲取時間對角膜內(nèi)皮細胞密度有統(tǒng)計學意義。采用多元線性回歸分析，設角膜內(nèi)皮細胞密度為因變量Y，自變量分別為年齡X1，死亡-獲取時間X2。將所得結(jié)果擬合回歸方程：Y=3 711.007-11.073X1-124.098X2，擬合度R=0.64，P＜0.05，回歸模型有統(tǒng)計學意義。供體角膜內(nèi)皮細胞密度隨供體年齡、死亡-獲取時間的變化規(guī)律符合線性趨勢，且呈負相關。

3 討論

供體角膜內(nèi)皮細胞密度及活性是評估植片質(zhì)量的重要指標，亦是穿透性角膜移植手術成功的保障。角膜內(nèi)皮細胞是連接角膜與前房的屏障，既能防止房水進入基質(zhì)層，也具有鈉泵功能將角膜基質(zhì)內(nèi)的水泵至前房維持角膜透明[7]。然而角膜內(nèi)皮細胞極易受到損傷，低氧、年齡＞65歲、炎癥及內(nèi)眼手術干擾等多種物理化學因素[8-10]均可造成角膜內(nèi)皮細胞損傷。角膜內(nèi)皮細胞損傷或是缺失后依靠相鄰的內(nèi)皮細胞通過伸展、擴大、移行進行修復，不僅會引起數(shù)量減少，而且形態(tài)大小也會發(fā)生變化，造成六角形細胞占比減少。由于角膜移植術后植片曲率變化較大，難以通過非接觸式角膜內(nèi)皮細胞鏡進行術后早期的角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量及形態(tài)進行精確檢測，而術后角膜內(nèi)皮的慢性失代償仍有待進一步長時間的隨訪。

本研究結(jié)果提示年齡和死亡-獲取時間對供體角膜植片內(nèi)皮細胞密度的影響是相互關聯(lián)的。供體角膜內(nèi)皮細胞密度與供體年齡、供體死亡-獲取時間呈負相關。目前已有關于供體角膜內(nèi)皮細胞密度與年齡、保存時間及方法、死亡-獲取時間等諸多因素的研究[11]。Armitage等[12]研究表明供體年齡和組織保存時間是影響器官培養(yǎng)法保存的角膜內(nèi)皮細胞密度的主要因素，較高的供體年齡和較長的保存時間都會降低供體角膜內(nèi)皮細胞密度。然而Langenbucher等[13]研究則認為儲存時間延長可能會增加角膜內(nèi)皮細胞丟失，但死亡-獲取時間與角膜內(nèi)皮細胞丟失無關。通常認為正常人群角膜內(nèi)皮細胞密度隨年齡增長而下降，60歲后人角膜內(nèi)皮細胞的數(shù)目與形態(tài)可發(fā)生變化，但對供體年齡與角膜術后成功率的研究認為角膜移植后的成功率和供體年齡并無關系[14]。目前這些研究的結(jié)果往往是相互矛盾的。本研究認為影響供體角膜內(nèi)皮細胞的因素既獨立存在也相互影響，對于用作穿透性角膜移植材料的角膜供體，年齡越大則要求死亡-獲取時間越短。

本研究所收集資料均用于臨床穿透性角膜移植手術，暫無死亡-獲取時間＞6 h的病例。研究發(fā)現(xiàn)，雖然在6 h內(nèi)所獲取的角膜植片的內(nèi)皮細胞密度均＞2 000個/mm2，但是隨死亡-獲取時間延長，所測角膜內(nèi)皮細胞密度呈線性下降趨勢。因此在進行增視性角膜移植手術，例如圓錐角膜患者的穿透性角膜移植手術時，不建議使用死亡-獲取時間＞6 h的供體植片。死亡-獲取時間對角膜內(nèi)皮細胞的影響機制是由于死后生命活動停止，使得機體處于缺氧狀態(tài)，房水停止生成，而原本在前房里的房水氧含量隨死亡時間延長而下降，最終導致角膜內(nèi)皮細胞丟失[15]。通常認為死亡-獲取時間＞12 h，角膜內(nèi)皮細胞將被滅活，因此國內(nèi)外眼庫多要求供體死亡時間＜6 h[16]。在我國由于供體的稀缺，謝立信等[17]曾將7枚死亡-獲取時間＞12 h的供體植片進行移植，監(jiān)測到受體術后半年角膜內(nèi)皮細胞數(shù)平均為1 230個/mm2，即供體死亡-獲取時間＞12 h也可用于穿孔感染等治療性角膜移植。國外也報道了類似研究，Parekh等[18]對死亡-獲取時間為0.3~25.6 h的733個角膜供體進行研究，發(fā)現(xiàn)在保存過程中，死亡-獲取時間對內(nèi)皮細胞沒有影響。然而，在對接受植片死亡-獲取時間＞10 h的患者進行隨訪的過程中發(fā)現(xiàn)，較長的死亡-獲取時間會對角膜移植患者移植后的內(nèi)皮細胞丟失有影響，因此，排除手術創(chuàng)傷外，死亡-獲取時間也是影響內(nèi)皮細胞密度的潛在因素之一。目前各國對死亡-供體保存時間尚未作嚴格要求，僅均強調(diào)應盡快摘取和保存供體眼組織。

本研究所監(jiān)測的角膜內(nèi)皮細胞密度與死亡-獲取時間和供體年齡相關性的回歸模型，擬合度僅為0.64，表明除死亡-獲取時間和供體年齡對角膜內(nèi)皮細胞起主要影響外，仍有其他因素影響著供體角膜內(nèi)皮細胞密度。此前已有研究[19]表明不同溫度對供體角膜內(nèi)皮細胞活性有影響，溫度越高，角膜內(nèi)皮細胞存活的時間越短。此外，供體眼部疾患，如既往白內(nèi)障、青光眼、玻璃體切除等內(nèi)眼手術史，眼部炎癥史、圓錐角膜及Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良等均可引起角膜內(nèi)皮細胞丟失；供體原發(fā)病如糖尿病、高血壓、慢性腎衰竭及代謝綜合征等，供體死亡前呼吸機使用時間等也被認為會引起角膜內(nèi)皮細胞丟失[20-21]。

除供體角膜植片在取材及保存過程中有內(nèi)皮細胞的損傷，穿透性角膜移植手術過程也會造成內(nèi)皮細胞損傷。因此，為了提高穿透性角膜手術的成功率，選用的供體角膜內(nèi)皮細胞密度應＞2 000個/mm2，無明顯形態(tài)異常，細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[2]。對臨床供體角膜植片內(nèi)皮細胞進行質(zhì)量監(jiān)測，分析角膜內(nèi)皮細胞密度的影響因素并探究其變化規(guī)律，可以為穿透性角膜移植手術優(yōu)選高質(zhì)量供體材料，從而提高穿透性角膜手術的成功率。