田琳琳 馮正平

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨組織微結構受到破壞導致骨骼脆性增加，骨折風險增加的慢性疾病。骨質(zhì)疏松和低骨量在老年人中越來越普遍，相對于骨密度檢查的不便及檢測延遲，骨轉(zhuǎn)換生化標志物可更早反映骨轉(zhuǎn)換的動態(tài)。骨轉(zhuǎn)換標志物分為骨形成生化標志物和骨吸收生化標志物，骨形成生化標志物包括骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(P1NP)、Ⅰ型前膠原羧基端前肽(P1CP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、骨保護素(OPG)等；骨吸收生化標志物包括Ⅰ型膠原氨基末端肽(NTX)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(CTX)、酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、吡啶啉(PYD)、脫氧吡啶啉(DPD)等。目前骨轉(zhuǎn)換生化標志物已廣泛應用于臨床，新的骨轉(zhuǎn)換生化標志物也在不斷被發(fā)現(xiàn)，本文就國內(nèi)外一些新的骨轉(zhuǎn)換生化標志物研究進展作一綜述。

1 骨鈣素

骨鈣素(osteocalcin，OC)又被稱為骨γ-羧基谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGLAP)，是BGLAP編碼的由非增殖期的成骨細胞特異合成并分泌的骨組織中含量最豐富的維生素K依賴的非膠原蛋白，參與骨基質(zhì)的合成、維持骨礦化。成骨細胞分泌的骨鈣素含有3種γ-羧基谷氨酸殘基，它們與骨羥基磷灰石基質(zhì)具有高親和力。當骨吸收時，由于破骨細胞吸收腔隙內(nèi)的pH值降低，骨鈣素上的羧基被清除，降低了其對骨骼的親和力，羧化不全的骨鈣素被釋放到循環(huán)中，所以測定血清中的骨鈣素水平既能反映成骨細胞活性，又能反映骨轉(zhuǎn)換的程度[1]。

Karsenty小組最早通過敲除Bglap和Bglap2基因產(chǎn)生骨鈣素缺乏(Ocn-/-)小鼠，發(fā)現(xiàn)Ocn-/-小鼠表現(xiàn)出骨小梁和皮質(zhì)骨的體積均增加，但其成骨細胞未增加、破骨細胞的數(shù)量增加；表明骨鈣素抑制成骨細胞功能和破骨細胞的生成，是骨形成的負性調(diào)節(jié)因子。對純B6基因背景下的骨鈣素缺失(OC-/-)小鼠研究發(fā)現(xiàn)[2]，與野生型小鼠相比，OC-/-小鼠骨小梁體積、骨小梁體積/總體積、連接密度和數(shù)量均顯著增加。OC-/-小鼠骨礦物中酸性磷酸鹽含量增加、血清P1NP濃度升高，表明其骨形成增加。另一方面，野生型小鼠和OC-/-小鼠的血清CTX濃度無顯著差異，表明其不影響骨吸收。最近有研究通過Neo基因替換Bglap和Bglap2基因生成骨鈣素缺乏(Ocn-/-)小鼠[3]，發(fā)現(xiàn)野生型和Ocn-/-小鼠股骨小梁的骨體積、厚度和數(shù)量無顯著差異，同時股骨松質(zhì)骨中的成骨細胞、破骨細胞、骨細胞和骨形成的參數(shù)是無顯著差異的，表明骨鈣素缺乏并不影響骨量、骨密度、骨形成或骨吸收。分析兩組小鼠的骨骼微結構發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中羥基磷灰石晶體的c軸方向與膠原纖維的排列方向是平行的，而Ocn-/-小鼠中膠原纖維排列正常，但羥基磷灰石晶體c軸平行于骨縱軸的取向程度減弱，導致骨礦化紊亂，骨強度降低，表示骨鈣素通過調(diào)整平行于膠原纖維的羥基磷灰石晶體c軸方向，影響骨骼礦化而影響骨質(zhì)量和強度而不是數(shù)量。

對絕經(jīng)后女性相關研究[4]發(fā)現(xiàn)，血清骨鈣素水平與腰椎和髖關節(jié)骨密度呈顯著負相關。印度的研究發(fā)現(xiàn)[5]，絕經(jīng)后女性骨鈣素水平顯著升高；相較于骨密度正常的婦女，低骨量及骨質(zhì)疏松婦女的血清骨鈣素水平也是顯著升高的。對絕經(jīng)后使用激素替代治療的婦女隨訪血清骨鈣素水平，發(fā)現(xiàn)3個月內(nèi)血清骨鈣素水平較基線發(fā)生顯著變化。在2型糖尿病患者中[6]發(fā)現(xiàn)，在男性和女性患者中，骨鈣素水平升高與全腰椎、股骨以及髖關節(jié)骨密度下降均存在顯著相關性。

血清骨鈣素能直接反映成骨細胞活性，其水平與骨密度呈負相關，且血清骨鈣素水平變化可作為評估骨質(zhì)疏松治療的早期療效評價指標。

2 CXC趨化因子配體12

CXC趨化因子配體12(C-X-C chemokine ligand 12，CXCL12)屬于CXC趨化因子家族，也被稱為基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell-derived D factor-1，SDF-1)，是一種由骨髓細胞中的基質(zhì)細胞分泌的小信號蛋白，在成骨細胞系細胞、血管周圍網(wǎng)狀細胞等均有表達，與CXC趨化因子受體4(CXCR4)結合形成SDF-1/CXCR4軸，為細胞存活創(chuàng)造微環(huán)境。CXCL12影響間充質(zhì)干細胞的遷移、生長、存活和分化，祖細胞通過CXCL12被募集到骨髓的壁龕形成成骨細胞和破骨細胞的前體細胞[7]。其促進破骨細胞前體細胞的趨化募集，募集后RANKL促進破骨細胞前體細胞成熟為破骨細胞[8]。同時CXCL12還通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶間接影響破骨細胞前體從循環(huán)向骨髓的遷移[9]。

在動物實驗中[10]發(fā)現(xiàn)CXCL12缺失小鼠股骨干中成骨細胞和破骨細胞特異性mRNA表達增加，加快了骨重建速度，但骨吸收和骨形成之間的平衡沒有改變。研究同時發(fā)現(xiàn)CXCL12通過抑制成骨細胞的生成和成骨細胞系細胞提供的破骨細胞支持來抑制骨轉(zhuǎn)換率。Pang等[11]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者成骨細胞中CXCL12的mRNA和蛋白表達明顯低于對照組，而破骨細胞中CXCL12的mRNA和蛋白水平明顯升高，提示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制可能是通過調(diào)控CXCL12基因表達抑制成骨細胞增殖和破骨細胞凋亡。Carbone等[12]對老年性骨質(zhì)疏松患者的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12血漿濃度與髖關節(jié)骨密度呈負相關，但與髖部骨折發(fā)生率無顯著相關性。表明在老年人中，血漿中CXCL12水平的升高與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關，但不能作為預測骨折風險的指標。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者腰椎骨折組血漿CXCL12水平顯著高于非骨折組，血漿CXCL12濃度與Genant半定量分級呈正相關。與絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松患者及對照組相比，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者股骨頸、全髖關節(jié)及腰椎的骨密度顯著降低，且血漿CXCL12水平與股骨頸、全髖和腰椎骨密度呈顯著負相關。血漿CXCL12水平升高也與視覺模擬評分(VAS)和Oswestry殘疾指數(shù)評分(ODI)的嚴重程度相關。此外，CXCL12水平的升高也與炎癥標志物TNF-α和骨吸收因子CTX-1呈正相關。這些研究發(fā)現(xiàn)血漿CXCL12水平與骨密度改變呈顯著的相關性，且其升高的水平可反映骨質(zhì)疏松的嚴重程度，可作為反映骨吸收的標志物。

3 凝溶膠蛋白

凝溶膠蛋白(Gelsolin，GSN)是鈣依賴性的凝溶膠蛋白超家族的成員，通過切斷、封端肌動蛋白絲，或使肌動蛋白聚集成核等方式來控制肌動蛋白的結構，作為肌動蛋白結合蛋白，參與破骨細胞胞足體的組裝和移動過程，GSN缺陷可阻礙破骨細胞胞足體的組裝，使骨質(zhì)量和骨強度增加。此外，GSN可能通過整合素的激活將破骨細胞與骨基質(zhì)聯(lián)系起來，從而最終激活破骨細胞，促進骨吸收。

但是在不同的研究中，GSN與骨密度之間的聯(lián)系并不是單一的。墨西哥的一項研究[14]發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后女性低骨量和骨質(zhì)疏松患者中血清GSN水平降低但組間差異無統(tǒng)計學意義。外周血單核細胞(PBMs)作為破骨細胞的前體，產(chǎn)生對破骨細胞發(fā)育重要的細胞因子，在骨代謝中發(fā)揮重要作用。一項對極高值及極低值骨密度高加索男性的PBMs的細胞質(zhì)蛋白組學分析[15]發(fā)現(xiàn)，極低骨密度患者GSN表達顯著升高。同樣一項對6 000多例樣本采取極端采樣法選取極高及極低骨密度樣本進行研究發(fā)現(xiàn)，血漿GSN水平在男性極高和極低骨密度人群中無顯著差異，但是在絕經(jīng)后女性中GSN水平在極低骨密度組顯著升高，與髖關節(jié)骨密度呈負相關[16]。兩項對絕經(jīng)后女性中GSN與骨密度的相關性研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，較絕經(jīng)前女性，絕經(jīng)后女性GSN水平顯著升高；較正常骨密度組比較，低骨量或骨質(zhì)疏松組中血漿GSN水平顯著升高，血漿GSN與絕經(jīng)后女性髖部骨密度之間呈現(xiàn)負相關性，且GSN是股骨頸、腰椎骨密度的獨立影響因素。目前研究表明血漿GSN或可作為診斷骨質(zhì)疏松的骨吸收生化標志物，但仍需對其進行更深入和廣泛的研究。

4 膜聯(lián)蛋白A2

膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一種表達在外周血單核細胞表面的鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能刺激單核細胞跨內(nèi)皮細胞的遷移和破骨細胞的形成。然而，ANXA2在骨重塑中的作用并不局限于破骨形成，通過對ANXA2缺失的MC3T3-E1小鼠成骨前體細胞的功能實驗[19]表明，ANXA2能夠促成骨前體細胞的增殖和分化，從而影響骨形成。

在絕經(jīng)后高加索女性中[20]發(fā)現(xiàn)ANXA2在低骨量和骨質(zhì)疏松患者中表達增加。近期有研究發(fā)現(xiàn)[21]，相對于無骨折患者，骨質(zhì)疏松性骨折患者的PBMs中ANXA2蛋白表達顯著升高。血漿ANXA2蛋白水平與中國老年人髖關節(jié)骨密度呈負相關，并且在骨密度極低的人群中顯著高于骨密度極高人群。同時研究觀察到，ANXA2以濃度依賴性的方式調(diào)節(jié)成骨細胞的生長，較低濃度的ANXA2蛋白可促進成骨細胞的生長，但其促進成骨細胞生長的作用在較高濃度(>50 ng/mL)時減弱，ANXA2對成骨細胞生長的雙重反向作用表明，血漿中ANXA2蛋白可能在體內(nèi)骨形成與骨吸收的偶聯(lián)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

這些研究表明ANXA2可能是骨質(zhì)疏松的潛在生化標志物，但是目前對于ANXA2的臨床研究少，血漿中ANXA2水平能否預測骨質(zhì)疏松還有待于進一步的縱向研究。

5 微小RNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，長度約22個核苷酸，大多數(shù)miRNAs是高度保守的，miRNA對成骨細胞及破骨細胞的增殖和分化均有調(diào)控作用，miRNAs通過降低Runx2的穩(wěn)定性和乙?；健⒆瓒鬢nt/β-catenin信號通路[22]等抑制成骨細胞的分化，削弱Hmga2對成骨細胞分化的抑制作用、抑制Smad7減輕Runx2的抑制作用、減輕c-Cbl對IP3K/ATK信號通路的拮抗作用等[23-25]促進成骨細胞的分化；miRNAs通過影響RANKL相關的因子表達抑制或促進破骨細胞的分化及功能[26]。

miRNAs在不同靶細胞中對骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的調(diào)控具有時序性和組織特異性。miR-29a通過結合RANKL的3’UTR抑制成骨細胞RANKL的分泌。抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(PCAF)介導的組蛋白3賴氨酸27(H3K27ac)乙酰化，降低H3K27ac在CXCL12啟動子中的富集，從而減少破骨細胞分化。在骨鈣素啟動子驅(qū)動的成骨細胞中過表達miR-29a的小鼠比野生型小鼠表現(xiàn)出更高的骨密度、骨小梁體積和骨質(zhì)量[27]。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)與年輕患者相比，miR-96在老年患者的骨髓間充質(zhì)干細胞中過度表達，使多種骨形成標志物表達下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性患者血清miR-96水平與血清骨堿性磷酸酶(SBALP)呈負相關。在大鼠和人類骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)的實驗中發(fā)現(xiàn)miR-203的過表達通過直接靶向Dkk1mRNA增加了許多骨形成標志物表達，從而得出miR-203可以促進BMSC向成骨細胞分化；在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)與正常受試者相比，骨質(zhì)疏松婦女的miR-203水平顯著降低[29-30]。使用RT-PCR檢測骨質(zhì)疏松患者和健康對照組之間的循環(huán)miRNAs。以人和小鼠成骨細胞系為研究對象，檢測miRNAs的誘導差異。作者發(fā)現(xiàn)150個檢測的miRNA中有14個在患者和健康對照之間顯著異常表達。結果顯示，骨質(zhì)疏松患者miR-328-3p、let-7 g-5p、miR-133b、miR-22-3p、miR-2861、miR-518 miR-100表達下調(diào)，而miR-10b-5p、miR-21、miR-125b、miR-127表達上調(diào)。MiR-10b-5p增加人、小鼠成骨細胞ALP活性和礦物質(zhì)沉積，促進成骨細胞分化。MiR-328-3p和let-7 g-5p降低ALP活性，抑制礦物質(zhì)沉積[31]。

miRNA以被包裹在胞囊內(nèi)或與相關蛋白質(zhì)結合的方式被釋放到細胞外液中稱為循環(huán)miRNA，是非常穩(wěn)定的物質(zhì)，可以使用金標準技術(如定量聚合酶鏈反應)進行測量，使得miRNA有潛力成為新的診斷骨質(zhì)疏松相關性疾病的生化標志物。

6 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)屬于免疫球蛋白超家族跨膜蛋白中的一員，被發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性分泌(ES)和可溶性分泌(S)兩種細胞外分泌形式，能夠與多種內(nèi)源性及外源性配體結合，在調(diào)節(jié)先天免疫應答中發(fā)揮重要作用。RAGE激活改變了骨細胞中大量下游信號通路，RAGE缺乏的破骨細胞整合素表達減少，抑制破骨細胞的成熟和粘附；在成骨細胞中，RAGE與配體結合激活增加了Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導，降低了細胞活力，激活了beclin1和lc3b介導的自噬[32]。

體外研究發(fā)現(xiàn)[33]，在RAGE缺失小鼠中分離的骨髓細胞中RANKL介導的破骨細胞分化/活性減弱，并且RAGE缺乏導致破骨細胞形態(tài)缺陷，這與破骨細胞分化減少以及骨吸收相關。這些破骨細胞缺陷是由于RAGE缺失骨髓源性巨噬細胞(BMMs)和破骨前細胞中αvβ3依賴信號通路的缺陷和肌動蛋白基細胞骨架組織的減弱。與野生型小鼠相比，RAGE缺乏小鼠骨密度、骨質(zhì)量顯著增加，破骨細胞數(shù)量減少[34]。RAGE缺乏小鼠的IL-6和吡啶啉水平顯著降低而ALP水平無明顯差異，提示RAGE缺乏可能主要影響破骨細胞功能，而不影響成骨細胞。去卵巢RAGE缺乏小鼠骨密度無顯著變化，而對照組小鼠骨密度顯著降低，表示RAGE缺乏小鼠的骨吸收受到抑制。RAGE缺乏導致破骨細胞形成和功能降低，骨密度、骨質(zhì)量增加。

但是不同的研究發(fā)現(xiàn)sRAGE與骨密度的相關性是不一致的。對84名絕經(jīng)后女性研究發(fā)現(xiàn)[35]，骨質(zhì)疏松和低骨量患者血清sRAGE水平顯著高于骨密度正常人群，且在骨質(zhì)疏松和低骨量人群中，sRAGE水平與骨折風險增加存在相關性。但在老年男性中研究[36]發(fā)現(xiàn)esRAGE與骨形成標志物P1NP、骨鈣素呈正相關，且這種相關性在患糖尿病的男性中更加顯著。同時有研究表示[37]，絕經(jīng)后女性2型糖尿病組與對照組sRAGE水平無顯著差異，同時血清sRAGE水平與2型糖尿病組的骨密度、骨折患病率、骨轉(zhuǎn)換標志物均沒有顯著的相關性。

RAGE被認為是刺激破骨細胞和成骨細胞分化和功能的信號事件的重要因素，低esRAGE水平已被報道為2型糖尿病患者椎體骨折的危險因素，其可能在監(jiān)測骨質(zhì)疏松進展方面具有潛在的診斷作用，但其在臨床應用上的研究較少，需進一步深入研究其在預測骨折風險上的價值。

目前國際上仍以骨密度作為診斷骨質(zhì)疏松的金標準，但隨著對骨轉(zhuǎn)換生化標志物的研究進展發(fā)現(xiàn)其能更早反映骨重建，且具有無創(chuàng)性、及時性等優(yōu)點，越來越多的骨轉(zhuǎn)換生化標志物已經(jīng)應用于臨床。對于新的骨轉(zhuǎn)換標志物還需要更深入及廣泛的研究其在臨床應用上的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性等特征，使其能更好地應用于骨代謝疾病的診斷及鑒別診斷、藥物開發(fā)以及骨質(zhì)疏松癥治療療效的臨床監(jiān)測。