尹麗穎 曹勁宏 宋 洋 馬 靜 吳 迪

（1.北京市懷柔區(qū)農產品質量安全綜合質檢站，北京 101400；2.北京市植物保護站，北京 100029）

在農產品質量安全檢測體系中，農藥殘留模型樣品對整個檢測質量控制體系起到核心作用，被廣泛應用于儀器性能驗證、實驗室質量控制、實驗室間比對、檢測技能競賽、農藥殘留研究等方面。蔬菜農藥殘留模型樣品制備一般有兩種方法，分別是自然機體污染法和空白基質加標法。前者是將藥物直接噴施于蔬菜上，得到含有藥物的陽性樣品，后者是將藥物標準溶液添加至空白樣品中。兩種方法得到的樣品存在很大差別，前者目標檢測物是與整個蔬菜相結合，符合現(xiàn)實蔬菜生產中噴施農藥實際情況，后者是目標檢測物僅在勻質后的蔬菜糜中。蔬菜中農藥殘留檢測的實施按流程可分為樣品制備、提取、凈化、測定、數(shù)據(jù)分析與結果報告等環(huán)節(jié)[1]。其中，樣品制備是檢測的關鍵環(huán)節(jié)之一，該環(huán)節(jié)采用空白基質加標法制備質控樣品，雖然具有制備操作過程簡單、可以任意設計樣品的加標濃度、可制備多種濃度的農藥殘留模型等優(yōu)點[2]，但從檢測環(huán)節(jié)上不能做到對樣品制備環(huán)節(jié)的質量控制，且容易出現(xiàn)樣品不均勻的問題。另外，其他一些對樣品處理、制備等環(huán)節(jié)需要有所質控的實驗研究，如研究不同清洗方法、不同儲存時間對蔬菜農藥殘留的影響等，均需要采用自然機體污染法制備蔬菜農藥殘留模型樣品。

蔬菜基質復雜，研制以實物為基質、均勻性與穩(wěn)定性好的農藥殘留模型樣品對農藥殘留檢測具有重要意義[3]，同時樣品中目標物的殘留濃度對實驗質量控制和研究也有重要影響，目標物殘留濃度太高或者太低都達不到質控和研究的目的。有研究表明，采取浸泡方式獲取的農藥殘留模型樣品要優(yōu)于噴施方式，可以滿足重復性、均勻性的需要[4]。但是在浸泡的過程中，最佳浸泡時間為多少，浸泡濃度與目標藥物殘留濃度水平的關系如何，如何實現(xiàn)農藥殘留模型樣品需要的藥物殘留濃度等卻鮮有報道。本研究分別選擇有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥中常見的毒死蜱、腐霉利、高效氯氟氰菊酯和克百威作為殘留對象，以櫻桃番茄和菠菜為基質，以浸泡方式制取這2種蔬菜中4種農藥的蔬菜農藥殘留模型樣品，采用氣相色譜法、高效液相色譜法測定蔬菜中農藥殘留量[1]，分析比較不同浸泡時間下2種蔬菜中的農藥殘留量，研究不同浸泡濃度與目標藥物殘留濃度水平之間的關系，為實現(xiàn)制備所需目標濃度的蔬菜農藥殘留模型樣品提供指導依據(jù)。

一、材料與方法

（一）主要儀器與試劑

1.主要儀器。GC－2010 Plus氣相色譜儀（配FPD檢測器，日本島津公司）；Nexis GC－2030氣相色譜儀（配ECD檢測器，日本島津公司）；LC－20AD高效液相色譜儀（配柱后衍生系統(tǒng)和熒光檢測器，日本島津公司）；YP502N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；EP3010組織搗碎機（德國博朗公司）；T18高速組織分散器（德國IKA公司）；ASE－24固相萃取裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MTN－2800W－24氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Vortex3000渦漩式混合器（德國普邁公司）；RE52－99旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2.主要試劑與耗材。農藥標準品［毒死蜱1 000 μg/mL、腐霉利1 000μg/mL、高效氯氟氰菊酯1 000 μg/mL、克百威1 000μg/mL，農業(yè)農村部環(huán)境質量測試中心（天津）］；乙腈、丙酮、甲醇、正己烷（均為色譜純，美國霍尼韋爾公司）；氯化鈉（分析純，140℃烘烤4 h，國藥集團化學試劑上海有限公司）；濾膜（0.22μm，有機溶劑膜，日本島津公司）；固相萃取柱（弗羅里矽柱1 000 mg/6 mL、氨基柱500 mg/6mL，日本島津公司）；0.05 mol/L氫氧化鈉溶液（英國Pickering公司）；OPA稀釋溶液（英國Pickering公司）；鄰苯二甲醛、巰基乙醇（均為色譜純，英國Pickering公司）；腐霉利原藥（純度95.0%）、毒死蜱原藥（純度98.8%）、高效氯氟氰菊酯原藥（純度97.0%）、克百威原藥（純度98.4%），均為東莞市泓信生物科技有限公司生產。

3.樣品采集。櫻桃番茄、菠菜采樣于北京市懷柔區(qū)某蔬菜生產基地，生產過程中未噴施過任何農藥。

（二）實驗方法

1.浸泡時間對蔬菜農藥殘留的影響。將高效氯氟氰菊酯原藥用丙酮溶解后，經自來水（16℃）稀釋制成農藥浸泡液。將櫻桃番茄和菠菜分別分成6份，去除泥土和腐爛部分，同時完全浸泡至上述農藥浸泡液中，浸泡時每5 min取出1份，置于通風櫥中瀝干表面水分。每取出1份蔬菜時，將其余浸泡的蔬菜翻動一次，確保蔬菜完全染毒，浸泡過程中室溫保持在20℃左右。全部浸泡結束后，將染毒后瀝干表面水分的蔬菜分別用保鮮袋包裝密封后放置于4℃冰箱中冷藏24 h，用組織搗碎機打碎，混勻，待測。

2.蔬菜農藥殘留模型樣品制備。將高效氯氟氰菊酯、腐霉利、毒死蜱、克百威原藥用丙酮溶解后，經自來水（16℃）稀釋制成不同濃度的混合農藥浸泡液。將同樣質量（50 g）的菠菜、櫻桃番茄去除泥土和腐爛部分，同時完全浸泡至上述混合農藥浸泡液中，浸泡20 min，浸泡過程中每5 min翻動一次蔬菜，確保蔬菜完全染毒，室溫保持在20℃左右。浸泡結束后，將蔬菜撈出，置于通風櫥中瀝干表面水分，用保鮮袋包裝密封后放置于4℃冰箱中冷藏24 h，用組織搗碎機打碎，混勻，待測。

3.蔬菜農藥殘留含量與浸泡濃度線性關系的建立。根據(jù)測得的櫻桃番茄和菠菜中各農藥殘留含量（y）和已知初始農藥浸泡濃度（x），分別建立2種蔬菜中農藥殘留含量與浸泡濃度的線性關系（y＝kx）。

4.樣品前處理。分別準確稱取對照組（空白）樣品和待測樣品（浸泡后樣品）25.0 g放入勻漿機中，加入50 mL乙腈，高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min。

從具塞量筒中分別吸取3份10 mL上層處理液，分別放入150 mL茄形瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀45℃水浴加熱，蒸發(fā)至近干，1份加入2mL丙酮，備用；1份加入2 mL正己烷，待凈化；1份加入2 mL甲醇－二氯甲烷（1∶99，V∶V）溶解殘渣，待凈化。

將上述加入丙酮的備用液用約3 mL丙酮分3次沖洗，每次丙酮用量約1 mL，完全轉移至5 mL容量瓶內定容，在渦旋混合器上混勻后過0.22μm濾膜，濾液供氣相色譜儀（FPD檢測器）測定。將上述加入正己烷的備用液過活化后的弗羅里矽柱，用5 mL丙酮－正己烷（10∶90，V∶V）沖洗后過柱2次，收集洗脫液在水浴溫度50℃條件下氮吹蒸發(fā)至＜5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，在渦旋混合器上混勻，濾液供氣相色譜儀（ECD檢測器）測定。將上述加入甲醇－二氯甲烷的備用液過活化后的氨基柱，用2 mL甲醇－二氯甲烷（1∶99，V∶V）沖洗后過柱2次，收集洗脫液在水浴50℃條件下氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2.5 mL，在渦旋混合器上混勻后過0.22μm濾膜，濾液供高效液相色譜儀測定。

5.儀器檢測條件。 （1）氣相色譜（配FPD檢測器）檢測條件。柱升溫程序：150℃保持2 min，以30℃/min升至200℃保持5 min，以5℃/min升至240℃（不保持，達到溫度后立即執(zhí)行新的升溫程序繼續(xù)升溫），以50℃/min升至280℃保持3.53 min。進樣口溫度為280℃；檢測器溫度為300℃；色譜柱流量為10 mL/min；色譜柱為Intertcap 17（1.0μm×0.53 mm×30 m）。（2）氣相色譜（配ECD檢測器）檢測條件。柱升溫程序：150℃保持2 min，以6℃/min升至270℃保持18 min。進樣口溫度為250℃；檢測器溫度為300℃；色譜柱流量為1.40 mL/min；色譜柱為Intertcap 1（0.25μm×0.25 mm×30 m）。（3）高效液相色譜檢測條件。流動相：A相為甲醇；B相為純水；C相為OPA稀釋溶液（含0.1 g鄰苯二甲醛、2 g巰基乙醇）；D相為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液。柱溫箱溫度為50℃；水解溫度為100℃；激發(fā)波長為330 nm；發(fā)射波長為465 nm。

6.數(shù)據(jù)處理。實驗采用外標法定量，用Excel進行數(shù)據(jù)處理。參照NY/T 761－2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》標準方法[1]，將上述處理過的樣品經過測定，得到峰面積，計算樣品中被測農藥殘留量（w，單位以mg/kg表示），計算方法見公式（1）。

公式（1）中，ρ為標準溶液中農藥的質量濃度（mg/L）；A為樣品溶液中被測農藥的峰面積；As為農藥標準溶液中被測農藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積（mL）；V2為吸取出用于檢測的提取溶液的體積（mL）；V3為樣品溶液定容體積（mL）；m為試樣的質量（g）。

7.質量控制。質量控制采取計算加標回收率的方法得出。稱取25.0 g櫻桃番茄和菠菜的勻質空白樣品（精確至0.1 g）于200 mL燒杯中，分別添加3個濃度梯度的4種農藥標準工作液250μL，工作液濃度分別為10.0、50.0、100.0 mg/L，對應添加濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/kg。在重復性條件下，對低中高水平加標的櫻桃番茄和菠菜樣品進行測定，按照上文“4.樣品前處理”的方法對樣品進行前處理。加標回收率計算方法見公式（2）。

公式（2）中，B為加標回收率（%）；Y為空白試樣中被測組分的含量（mg/kg）；Y1為加標試樣中被測組分的含量（mg/kg）。

二、結果與分析

（一）方法檢出限按照上述儀器條件建立的氣相色譜和液相色譜方法，以3倍信噪比所對應的濃度值確定4種農藥的檢出限，結果顯示，高效氯氟氰菊酯的檢出限為0.000 26 mg/kg，腐霉利的檢出限為0.000 30 mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.004 70 mg/kg，克百威的檢出限為0.000 94 mg/kg。

（二）質量控制結果通過3次平行加標實驗，4種農藥在櫻桃番茄中的平均回收率為86.46%～104.47%，RSD均≤5%（見表1）；4種農藥在菠菜中的平均回收率為83.82%～109.11%，RSD均≤5%（見表2）。該分析方法的準確性符合GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[5]的要求，實驗檢測結果可信。

表1 櫻桃番茄中4種農藥的加標回收率 （n＝3）

表2 菠菜中4種農藥的加標回收率 （n＝3）

（三）不同浸泡時間對蔬菜農藥殘留含量的影響將上文“一、材料與方法”中“1.浸泡時間對蔬菜農藥殘留的影響”的待測樣品按照上述前處理方法及儀器條件進行測定，實驗結果見表3。由表3可以看出，隨著農藥浸泡時間的增大，櫻桃番茄和菠菜中農藥殘留含量的變化趨勢基本一致，前15 min內，農藥殘留含量不穩(wěn)定，20 min后農藥殘留含量變化相對平緩，考慮到盡量減少浸泡時間和實驗結果的穩(wěn)定性，選擇20 min為最佳浸泡時間。

表3 浸泡時間對蔬菜農藥殘留含量的影響

（四）蔬菜農藥殘留含量與浸泡濃度之間的線性關系將上文“一、材料與方法”中“2.蔬菜農藥殘留模型樣品制備”的待測樣品按照上述前處理方法及儀器條件進行測定，實驗結果見表4。

表4 兩種蔬菜在不同濃度農藥浸泡處理后的農藥殘留含量

分別根據(jù)不同農藥浸泡濃度對應的櫻桃番茄和菠菜中農藥殘留含量，以浸泡濃度為橫坐標，農藥殘留含量為縱坐標，繪制農藥殘留含量與浸泡濃度之間的趨勢圖（見圖1）。如圖1所示，隨著農藥浸泡濃度的增大，櫻桃番茄和菠菜中農藥殘留含量均增大，且與農藥種類無關，增大趨勢呈線性關系，其中菠菜基質對應的線性方程為y＝1.375x；櫻桃番茄基質對應的線性方程為y＝0.035x；相關系數(shù)R2均＞0.99，線性關系良好。

圖1 在不同浸泡濃度下菠菜和櫻桃番茄中農藥殘留量的變化趨勢

三、結論

本研究分別選擇有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類農藥中常見的毒死蜱、腐霉利、高效氯氟氰菊酯和克百威作為農藥殘留對象，以櫻桃番茄和菠菜為基質，以浸泡方式制取以上2種蔬菜中4種農藥的蔬菜農藥殘留模型樣品，采用氣相色譜法、高效液相色譜法測定蔬菜中農藥殘留量，得出最佳農藥浸泡時間為20 min；在浸泡時間為20 min的條件下，目標農藥殘留含量與浸泡濃度之間呈線性關系，線性方程分別為y＝1.375x（菠菜）、y＝0.035x（櫻桃番茄）。以浸泡方式制取農藥殘留模型樣品，在浸泡、翻動、晾干表面水分等環(huán)節(jié)有很大的主觀性，該方法適合大批量制取大致濃度的農藥殘留樣品，以用于快速檢測技能競賽、農藥殘留研究實驗等，若將其應用于能力驗證、質量控制等，還需要對樣品進行定值，并進行均一性和穩(wěn)定性實驗。