劉明雨 聶繼云 沈友明 韓令喜 高小琴

（1.中國農業(yè)科學院果樹研究所，遼寧興城 125100；2.青島農業(yè)大學園藝學院，農業(yè)農村部果品質量安全風險評估實驗室（青島），青島市現(xiàn)代農業(yè)質量與安全工程重點實驗室，山東青島 266109）

蘋果屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus），為多年生落葉果樹，是世界第二大果樹，產量僅次于柑橘[1]。我國是世界上最大的蘋果生產國和消費國，蘋果產量約占全球的50%[2]。蘋果病蟲害是影響我國蘋果產業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的限制性因素，其防治有農業(yè)防治、生物防治、物理防治、化學防治等多種方法，其中化學防治是最常用的防治方法[3～4]。但化學農藥如不能科學合理地使用，會導致農藥殘留增加甚至超標，進而影響蘋果品質和安全性，危害消費者健康[5]。制定農藥最大殘留限量標準，是保障農產品質量安全、促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護消費者健康的基礎，并為農產品安全評價與監(jiān)管執(zhí)法提供重要依據(jù)[6]。

GB 2763－2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》已于2021年9月正式實施并代替此前的版本[7]。該標準規(guī)定了蘋果中240項農藥最大殘留限量，其中62項為臨時限量。但該標準與國際標準仍有差距，我國蘋果中農藥殘留臨時限量范圍為0.01～30 mg/kg，歐盟食品安全局（EFSA）對于無具體限量標準且不屬于豁免物質的農藥殘留，都以方法檢出限或0.01 mg/kg為限值[8]。鑒于此，加強農藥最大殘留限量的基礎性研究工作，建立快速準確的農藥殘留檢測方法，為制定農藥殘留限量提供技術支持具有重要意義。本文以蘋果中允許使用且只有臨時限量的4種殺蟲劑（氟苯蟲酰胺、氟啶蟲胺腈、螺蟲乙酯、氯蟲苯甲酰胺）和7種殺菌劑（吡噻菌胺、丁香菌酯、多果定、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、嗪氨靈、噻霉酮）為檢測對象，研究建立快速、準確、簡便的多殘留同時檢測方法，有利于農藥殘留限量標準的實施和蘋果中農藥的殘留監(jiān)管。

蘋果農藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法[9]、氣相色譜－串聯(lián)質譜法[10]、高效液相色譜法[11]和高效液相色譜－串聯(lián)質譜法（HPLC－MS/MS）[12]。與一般HPLC－MS/MS方法相比，超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法（UPLC－MS/MS）檢測效率更高[13]。農藥殘留檢測前處理方法多樣[14]，QuEChERS方法因具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全的優(yōu)點，而被廣泛采用[15～16]。2021年9月施行的GB 23200.121－2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜－質譜聯(lián)用法》[17]，采用QuEChERS前處理方法結合液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質譜同時測定331種農藥及44種農藥代謝物。本文選取的11種農藥中，已有8種農藥在GB 23200.121－2021中有相應檢測方法，但仍有3種農藥無配套殘留檢測方法。目前，關于蘋果樣品中上述11種農藥殘留檢測的文獻報道較少，為了解當前蘋果中11種農藥的殘留情況，提高蘋果質量安全管理水平，本文參考GB 23200.121－2021，研究建立QuEChERS結合UPLC－MS/MS同時檢測蘋果中吡噻菌胺等11種農藥的分析方法。

一、材料與方法

（一）儀器、試劑與材料Xevo TQ超高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀 （美國Waters公司）；CF16RXII立式大容量高速離心機（日本Hitachi公司）：Milli－QDirecet 8全自動超純水機（美國Millipore公司）；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm，美國Waters公司）；JYL－C20九陽料理機（中國九陽股份有限公司）。

乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸和乙酸乙酯（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；乙二胺－N－丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、多壁碳納米管（MWCNTs）、十八烷基硅烷（C18）、佛羅里硅土（Florisil）（美國Varian公司）；無水MgSO4（優(yōu)級純，天津市津科精細化工研究所）；NaCl（優(yōu)級純，天津市豐川化學試劑技術有限公司）；0.22μm尼龍有機濾膜（Nylon，美國Fine Scientific公司）；農藥標準品：吡噻菌胺、丁香菌酯、多果定、氟苯蟲酰胺、氟吡菌酰胺、氟啶蟲胺腈、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯、氯蟲苯甲酰胺、嗪氨靈和噻霉酮（純度≥99.4%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。

富士蘋果樣品采于我國兩大蘋果主產區(qū)，即渤海灣產區(qū)（樣品數(shù)為山東n＝28、遼寧n＝10、河北n＝21）、黃土高原產區(qū)（樣品數(shù)為陜西n＝24、甘肅n＝16、山西n＝21、河南n＝10），共計采集130份樣品；嘎啦蘋果樣品采于黃土高原產區(qū)（樣品數(shù)為陜西n＝16、河南n＝8），共計采集24份樣品。

（二）標準溶液的配制

1.標準儲備液。11種農藥標準品，分別用甲醇稀釋配制成100.0 mg/L的標準儲備液。準確吸取11種農藥標準儲備液各適量，以甲醇定容，得到10 mg/L的混合標準儲備液，－20℃冷凍保存。

2.標準工作液。準確移取一定體積的混合標準儲備液，分別用甲醇逐級稀釋成1、2、5、10、20、50、100、200和500μg/L的混合標準工作液。

3.基質空白標準工作溶液。用空白基質溶液將混合標準儲備液按相同比例稀釋成1、2、5、10、20、50、100、200和500μg/L的基質空白標準工作溶液。

（三）樣品前處理準確稱取10.00 g（精確至0.01 g）已勻漿的蘋果樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，振蕩渦旋5 min。再加入NaCl 2 g和無水MgSO44 g，再次振蕩渦旋5 min，以9 000 r/min離心5 min。吸取2 mL上清液于15 mL離心管，加入100 mg PSA，渦旋1 min，以4 500 r/min離心5 min，取適量上清液過0.22μm有機濾膜，待測。

（四）儀器條件

1.色譜條件。ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm）色譜柱；柱溫為40℃。流動相A為甲醇，B為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫程序為：0.0～2.0 min，10%A～90%A；2.0～4.0 min，90%A；4.0～4.01 min，90%A～10%A；4.01～5.5 min，10%A。流速為0.4 mL/min；進樣體積為5μL；樣品室溫度為10℃。

2.質譜條件。電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正負同時掃描；毛細管電壓為3.0 kV；檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為500℃；去溶劑氣為氮氣，流量為800 L/h；錐孔氣為氮氣，流量為50 L/h。其他參數(shù)見表1。

二、結果與分析

（一）質譜及色譜條件優(yōu)化將11種農藥的1 mg/L的單個標準品由注射泵直接注入質譜，以優(yōu)化MRM離子對。在全掃描模式下（m/z50～1 000）進行母離子掃描。針對每個目標分析物的母離子，測試并優(yōu)化了每種農藥的錐孔電壓。選擇優(yōu)化后的母離子在MRM模式下掃描產物離子，為每個目標分析物選擇了兩個子離子，同時優(yōu)化子離子的碰撞電壓（見表1）。

表1 11種農藥的質譜參數(shù)及液相保留時間

色譜條件優(yōu)化的主要目的是增大目標物之間或目標物與雜質之間的分離度，提高檢測的靈敏度與準確度[18]。本文選擇了反相色譜常用的流動相體系甲醇－0.1%甲酸水溶液、甲醇－5 mmol/L乙酸銨水溶液和甲醇－含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液進行測試和比較，以獲得最佳分辨率和峰形響應強度。乙酸銨能促進化合物的離子化效率，同時加入甲酸后，目標化合物響應增強，峰形變尖銳，靈敏度變高。結果表明，在甲醇－含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液流動相組成下，11種農藥的峰形得到了有效的改善，峰形更加尖銳和對稱，并且響應值最高。因此，選擇甲醇－含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液作為梯度洗脫的流動相。

（二）提取方法的優(yōu)化鑒于11種農藥的分子極性差異，本研究考察了乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸－乙腈溶液3種試劑的提取效果，對11種農藥在空白蘋果基質中加標回收率進行比對，加標量為200μg/kg，結果見圖1?？梢钥闯?，使用乙腈作為提取劑時，各組分的回收率較高，均達到80%以上并且低于120%，提取出的雜質較少；使用乙酸乙酯提取時無法提取出多果定和噻霉酮兩種農藥。同時，試驗還考察了乙腈中添加甲酸時對11種農藥的提取效果，結果發(fā)現(xiàn)，11種農藥的總體回收率在71%～112%之間，說明在提取劑中加入甲酸并不能提高提取率。此外，選擇乙腈作為提取劑比其他提取劑的提取效果好，證實了前人研究中所提出的，與其他溶劑相比，乙腈對大多數(shù)化合物具有適當?shù)臉O性，提取劑選擇乙腈能產生更好的回收率和相容性[19]，因此最終確定乙腈作為提取劑。

圖1 不同提取劑對11種農藥回收率的影響

（三）吸附劑的選擇及優(yōu)化QuEChERS方法常用的吸附劑有PSA、C18、GCB、MWCNTs、Florisil[20]，其中PSA主要用于去除樣品提取物中的脂肪酸、有機酸、色素和糖類；C18被證實可以有效去除提取物中的許多非極性或中等極性的干擾物，如脂肪、甾醇和揮發(fā)性油；GCB和MWCNTs用于去除色素，如類胡蘿卜素和葉綠素，但它們二者對含苯官能團的化合物有較強吸附作用，會降低其回收率[21]。因此，本試驗采用空白基質加標回收法進行比較，加標量為200μg/kg，分別考察了PSA（200 mg）、C18（200 mg）、GCB（100 mg）、MWCNTs（20 mg）、Florisil（200 mg）5種吸附劑單獨使用對待測農藥回收率的影響，結果見圖2。如圖2所示，當使用200 mg Florisil作為吸附劑時，多果定的回收率僅為6%。MWCNTs和GCB具有高縱橫比和表面積，對有機分子表現(xiàn)出很強的保留能力。在本試驗中，使用MWCNTs和GCB單獨作為吸附劑時，11種農藥的添加回收率分別為11%～110%和6%～126%，部分目標農藥的回收率偏低。當200 mg PSA和200 mg C18分別作為吸附劑用于2 mL蘋果提取液時，11種農藥的回收率分別為61%～119%和78%～114%，表明它們對農藥的吸附效果較小。

圖2 不同吸附劑對11種農藥回收率的影響

進一步對C18和PSA的用量進行探究，目的是使每一種農藥獲得滿意的回收率?？疾觳⒈容^了不同使用量的PSA（50、100、150和200 mg）和C18（50、100、150和200 mg）對11種農藥回收率的影響，結果見表2，隨著PSA、C18用量的增加，蘋果乙腈提取液的脫色效果逐漸增強。當使用50～200 mg C18時，11種農藥的平均回收率在59.6%～125.0%之間；使用50～200 mg PSA時，11種農藥的平均回收率在60.6%～121.8%之間。只有在100 mg PSA用量下每種農藥的平均回收率都大于90%，顯著優(yōu)于其他的用量條件，最終選擇100 mg PSA為本試驗的吸附劑。

表2 蘋果基質中不同PSA和C18用量下11種農藥的回收率 （n＝3，%）

（四）11種農藥的線性方程、檢出限、定量限及基質效應評價基于已優(yōu)化的分析條件，分別采用乙腈和蘋果空白基質提取液作為標準溶液的稀釋液，配制11種農藥的基質匹配標準溶液，設置9個濃度梯度 （1、2、5、10、20、50、100、200、500μg/L），以化合物濃度為橫坐標，各目標化合物對應峰面積為縱坐標，獲得線性方程以評估方法線性范圍，結果見表3。以滿足添加回收率在70%～120%范圍內且RSD＜20%要求的最低加標水平為定量限（LOQ）；以在規(guī)定的試驗條件下，在蘋果基質中能檢測到11種農藥的最低濃度為檢出限（LOD）[22]。從表3可以看出，蘋果基質中吡噻菌胺、丁香菌酯、多果定、氟苯蟲酰胺、氟吡菌酰胺、氟啶蟲胺腈、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯、氯蟲苯甲酰胺、嗪氨靈和噻霉酮在濃度范圍內線性關系良好，R2≥0.9 9，11種農藥的LOD為0.1～4.0μg/kg，LOQ為2～10μg/kg。同時，相較于GB 23200.121－2021中已有水果基質中農藥的檢測方法，5種農藥（吡噻菌胺、丁香菌酯、氟吡菌酰胺、氟啶蟲胺腈和螺蟲乙酯）的定量限均低于標準中的定量限，3種農藥（氟苯蟲酰胺、氟唑菌酰胺和氯蟲苯甲酰胺）的定量限與標準中的定量限相同。

表3 11種農藥在蘋果基質中的線性方程、相關系數(shù)、基質效應、檢出限和定量限

植物源性食品中色素、有機酸和脂肪等雜質易引起基質增強或抑制效應，研究表明，基質種類、基質數(shù)量和目標物化學性質對基質效應有一定影響[23]。基質效應（ME）根據(jù)公式“ME＝（基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率－1）×100%”進行評估，當ME＞0時，表現(xiàn)為基質增強效應；當ME＜0時，為基質抑制效應。此外，若|ME|≤20%，表示弱基質效應；若|ME|在20%～50%之間，則表示中等基質效應；若|ME|＞50%，表示強基質效應[24]。結果顯示，在蘋果基質中多果定表現(xiàn)出強基質效應，其余農藥表現(xiàn)出弱或中等基質效應。空白蘋果基質TIC色譜圖見圖3。為降低基質效應對蘋果中農藥分析的影響，本文采用蘋果基質匹配標準溶液繪制的標準校正曲線對蘋果中11種農藥定量，提高分析可靠性[25]。

圖3 空白蘋果基質TIC色譜圖

（五）方法的回收率和精密度在空白蘋果樣品中添加11種目標農藥的混合標準溶液，在2、4、10、20、100、200μg/kg加標水平下進行回收率試驗，每個水平重復5次，結果見表4。11種農藥的平均回收率為82.2%～118.1%，相對標準偏差范圍為0.3%～17.4%，方法回收率和精密度均滿足農藥殘留檢測要求。

表4 蘋果基質中11種農藥的加標回收率及相對標準偏差 （n＝5）

（六）實際樣品檢測應用建立的方法對采自全國蘋果主產區(qū)（渤海灣產區(qū)、黃土高原產區(qū)）7個省份的154份蘋果樣品進行檢測。蘋果中11種農藥的殘留水平如表5所示，共檢測出7種農藥，殘留水平均遠低于我國臨時最大殘留限量。在氯蟲苯甲酰胺陽性樣品中，僅有1個樣品殘留水平略高于歐盟最大殘留限量；在噻霉酮陽性樣品中，7個樣品殘留值超過歐盟最大殘留限量，其余陽性檢出樣品殘留值均遠低于歐盟最大殘留限量。

表5 蘋果樣品中的農藥檢出情況

三、結論

本文采用QuEChERS前處理法，結合超高效液相色譜－串聯(lián)質譜測定，建立了蘋果中11種農藥（吡噻菌胺、丁香菌酯、多果定、氟苯蟲酰胺、氟吡菌酰胺、氟啶蟲胺腈、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯、氯蟲苯甲酰胺、嗪氨靈和噻霉酮）殘留的同時檢測方法。方法學考察結果顯示，11種農藥的LOD為0.1～4.0μg/kg，LOQ為2～10μg/kg，標準曲線R2≥0.99，平均回收率為82.2%～118.1%，RSD為0.3%～17.4%；部分農藥定量限低于我國現(xiàn)行國家標準，能夠滿足蘋果中11種農藥殘留的快速檢測需要。采用所建立的方法對154份蘋果樣品進行檢測，結果顯示，檢出的7種農藥其殘留水平遠低于我國臨時最大殘留限量。本文所建立的檢測方法操作簡便、高效靈敏、準確度好，可為蘋果中相關農藥的殘留監(jiān)測提供技術支撐。