黃一摯，趙斌斌，盤雯慧，孫平良，韋凱燕，陳 朝△

（1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530023）

安腸方為廣西名中醫(yī)肖振球教授治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、黑順片、干姜、木香、白術(shù)、炒雞內(nèi)金、赤石脂、甘草等中藥組成，有健脾益氣、清熱祛濕、活血化瘀、行氣導(dǎo)滯功效，臨床使用20余年，療效顯著［1-2］。藥理研究表明，安腸方可通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB［3］、miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB［4］等信號通路抑制炎性因子表達(dá)，從而減輕腸黏膜炎性反應(yīng)?；谠摲酱_切的臨床療效，本課題組前期將其研制成院內(nèi)制劑安腸液。為保證該制劑安全有效，本研究中對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)考察，采用薄層色譜（TLC）法對制劑中黃芪、木香、白術(shù)、甘草進(jìn)行定性鑒別。由于處方中的黑順片含有毒性成分雙酯型生物堿，故采用TLC法對其進(jìn)行限量檢查。黃芪為方中主藥，可補(bǔ)氣固表、托毒排膿、斂瘡生肌，而黃芪甲苷是黃芪發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［5-6］，故采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中黃芪甲苷含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AB型高效液相色譜儀（包括SIL-20AC型自動進(jìn)樣器、CTO-20AC型色譜柱恒溫箱、ELSD-LTⅡ型低溫型蒸發(fā)光散射檢測器，日本Shimadzu公司）；ME204/02型電子分析天平（梅特勒-托利多國際儀器有限公司）；Basic-Q30型純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；DA-101型大孔吸附樹脂（北京索萊寶科技有限公司，批號為0715D011）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

安腸液（批號分別為20200907，20200910，20200914，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室中試生產(chǎn)）；黃芪對照藥材（蒙古黃芪，批號為120974-201813）、白術(shù)對照藥材（批號為120925-202013）、木香對照藥材（批號為120921-202010）、甘草對照藥材（批號為120904-202021）、黃芪甲苷對照品（批號為110781-202118，含量96.8%）、烏頭雙酯型生物堿對照品（批號為112029-201601，含新烏頭堿31.7%、次烏頭堿30.0%、烏頭堿31.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

木香［7］：取樣品30 mL，用石油醚（60～90℃）20 mL萃取2次，收集有機(jī)相層，室溫?fù)]干，殘留物加乙酸乙酯1 mL使溶解，即得供試品溶液。取木香對照藥材0.5 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）15 min，濾紙真空過濾，室溫?fù)]干，殘留物加乙酸乙酯溶解至1 mL，即得對照藥材溶液。按安腸液處方和工藝制備缺木香的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（17∶3，V/V）為展開劑，預(yù)飽和10 min，展距8 cm，取出后晾干約2 min，采用1%香草醛硫酸溶液顯色，晾干后置105℃烘箱加熱至顯清晰紫色斑點(diǎn)，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置有1個(gè)紫色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

黃芪［8-9］：取樣品適量，5 000 r/min離心5 min，取上清液20 mL，加水10 mL混勻，用水飽和正丁醇50 mL輕緩搖動提取3次，收集正丁醇層，合并，氨試液充分洗滌2次（每次30 mL），取上層液，水浴蒸干，殘留物加水10 mL使溶解，置DA-101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.8 cm，柱高14 cm，濕法裝柱），依次用水80 mL、40%乙醇40 mL洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘留物加甲醇溶解并定容至5 mL中，即得供試品溶液。取黃芪對照藥材1 g，加水150 mL，煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至20 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取黃芪甲苷對照品1 mg，精密稱定，加甲醇1 mL混勻，即得對照品溶液。按安腸液處方和工藝制備缺黃芪的樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照品溶液各5μL，對照品溶液1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）5～10℃放置的下層溶液為展開劑，展距8 cm，取出后晾干約2 min，以10%硫酸乙醇溶液顯色，晾干后置105℃烘箱加熱至顯現(xiàn)清晰棕褐色斑點(diǎn)，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置有1個(gè)棕褐色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

白術(shù)［10-11］：取樣品20 mL，用石油醚（60～90℃）20 mL萃取2次，收集有機(jī)相層，自然揮干，殘留物加甲醇溶解至1 mL，即得供試品溶液。取白術(shù)對照藥材2.0 g，加水50 mL，加熱回流提取30 min，濾過，濾液濃縮至20 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按安腸液處方和工藝制備缺白術(shù)的樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（19∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，預(yù)飽和10 min，展距8 cm，取出后晾干約2 min，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，晾干后置105℃烘箱加熱至顯現(xiàn)清晰藍(lán)色斑點(diǎn)，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置有1個(gè)藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

甘草［12］531-532：取樣品適量，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，置DA-101型大孔吸附樹脂柱（20 g，內(nèi)徑1.8 cm，濕法裝柱）上，先用水80 mL洗脫，棄去洗脫液，再用60%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘留物加甲醇溶解至1 mL，即得供試品溶液。取甘草對照藥材0.5 g，加水150 mL，煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至10 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按安腸液處方和工藝制備缺甘草的樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，預(yù)飽和10 min，展距8 cm，取出后晾干約2 min，以1%香草醛硫酸溶液為顯色劑，晾干后置105℃烘箱加熱至顯現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置有1個(gè)綠色熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 烏頭雙酯型生物堿限量檢查［12］785-786，［13］

取樣品50 mL，加氨水調(diào)pH至10，用乙醚50 mL萃取3次，收集乙醚萃取層，揮干乙醚，殘留物加無水乙醇溶解至1 mL，即得供試品溶液。按安腸液處方和工藝制備缺黑順片的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取缺黑順片的陰性樣品50 mL，加入烏頭雙酯型生物堿對照品1.50 mg，同供試品溶液制備方法制備含烏頭雙酯型生物堿對照品（1.50 mg/mL）的陰性對照品溶液。取烏頭雙酯型生物堿對照品適量，加無水乙醇制成系列質(zhì)量濃度（3.00，1.50，0.75 mg/mL）的烏頭雙酯型生物堿對照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，3個(gè)質(zhì)量濃度的烏頭雙酯型生物堿對照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-濃氨試液（5∶5∶1，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展距8 cm，取出后晾干，稀碘化鉍鉀試液顯色，置日光燈下檢視。結(jié)果僅質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL和1.50 mg/mL的烏頭雙酯型生物堿對照品溶液色譜顯3個(gè)清晰斑點(diǎn)，故雙酯型生物堿的檢測限為7.5μg（1.50 mg/mL×5μL=7.5μg），詳見圖2 A；供試品溶液色譜中，在與烏頭雙酯型生物堿對照品溶液（1.50 mg/mL）色譜相應(yīng)的位置未出現(xiàn)斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，詳見圖2 B。

2.3 含量測定［12］315，［14-15］

2.3.1 檢測條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack CLC-ODS柱（150 mm×6.0 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（38∶62，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：365 nm；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：20μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：氮?dú)饬魉贋?.8 L/min，漂移管溫度為55℃，增益為2。

2.3.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品0.024 1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.964 mg/mL的對照品溶液；以2.1項(xiàng)下方法制備黃芪供試品溶液；按安腸液處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，再按2.1項(xiàng)下方法制成不含黃芪的陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取上述3種溶液各20μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果黃芪甲苷保留時(shí)間為11.23 min，分離度為3.56，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)為6 935，陰性對照無干擾。詳見圖3。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.024 1，0.048 2，0.096 4，0.192 8，0.385 6 mg/mL的系列對照品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=1.767×106X-9.076×103（r=0.999 6，n=5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷質(zhì)量濃度在0.024 1～0.385 6 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液（0.096 4 mg/mL）20μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積；取同一對照品溶液20μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定3 d，每天連續(xù)測定3次。結(jié)果黃芪甲苷日內(nèi)精密度和日間精密度峰面積的R SD分別為1.05%（n=6）和1.26%（n=3），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號20200907）適量，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下分別于0，2，4，8，12，24，48 h時(shí)，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為2.21%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號20200907）6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定記錄峰面積，并計(jì)算樣含量。結(jié)果樣品中黃芪甲苷含量的平均值為0.029 1 mg/mL，R S D為1.84%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號20200907）9份，每份10 mL，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.289 2 mg/mL的對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.3.4 含量測定

取3批樣品（批號分別為20200907，20200910，20200914），按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算黃芪甲苷含量。結(jié)果3批樣品中黃芪甲苷含量分別為0.029 1，0.027 2，0.028 1 mg/mL，平均含量為0.028 2 mg/mL。考慮藥材產(chǎn)地、炮制等影響因素，以平均含量下調(diào)30%作為本品的含量限度標(biāo)準(zhǔn)，暫定本品每1 mL含黃芪以黃芪甲苷（C41H68O14）計(jì)，不得少于20μg。

3 討論

TLC法易受樣品的預(yù)處理、展開劑等因素影響，其中展開劑是影響TLC的關(guān)鍵因素。為了獲得較好的分離度，預(yù)試驗(yàn)中對各藥材考察了多個(gè)展開劑體系，其中木香的展開劑考察了環(huán)己烷-丙酮（10∶3，V/V）［16］和環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（8∶1∶1，V/V/V）［17］；白術(shù)的展開劑考察了石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（50∶1，V/V）［18］和環(huán)己烷-異丙醇（20∶1，V/V）［19］；甘草的展開劑考察了乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水（7∶1∶1∶21，V/V/V/V）［20］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別采用本研究中所選展開系統(tǒng)時(shí)分離效果更好，斑點(diǎn)清晰，專屬性更強(qiáng)。

雙酯型生物堿的限量檢查方法主要有TLC法［12］785-786和HPLC法［21］。安腸液處方中黑順片以烏頭雙酯型二萜類生物堿烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿為毒性最強(qiáng)，為保障制劑的安全性，本研究中采用TLC法對安腸液進(jìn)行烏頭雙酯型生物堿限量檢查［22-23］。依據(jù)2020年版《中國藥典（一部）》附子項(xiàng)下規(guī)定，黑順片含烏頭雙酯型生物堿以新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的總量計(jì)不得過0.02%，黑順片的最大日服用量為15 g，折算烏頭雙酯型生物堿日服用量限度約為3 mg。根據(jù)安腸液用法用量（口服或灌腸，1日2次，每次50 mL，即日使用量為100 mL）計(jì)算，得安腸液烏頭雙酯型生物堿的限量應(yīng)為每1 mL樣品不得過30μg（30 mg/100 mL=30μg/mL）。本研究結(jié)果顯示，50 mL安腸液供試品溶液點(diǎn)樣10μL在TLC圖上出現(xiàn)新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿斑點(diǎn)顏色淺于1.50 mg/mL對照品溶液點(diǎn)樣5μL的斑點(diǎn)，提示每1 mL制劑中雙酯型生物堿的限量低于30μg（1.50 mg/mL×1 mL/50 mL=30μg/mL），符合烏頭雙酯型生物堿含量限度標(biāo)準(zhǔn)。

由于處方藥味多、黃芪甲苷含量低，樣品前處理是黃芪甲苷含量測定的關(guān)鍵步驟。預(yù)試驗(yàn)中，供試品溶液制備方法曾考察樣品經(jīng)正丁醇萃取、氨水堿化后直接進(jìn)樣測定［24-25］，但發(fā)現(xiàn)供試品溶液色譜峰背景信號多，對黃芪甲苷有干擾，供試品進(jìn)一步經(jīng)對三萜皂苷類成分選擇性較高的DA-101型大孔樹脂富集純化后測定［15，26］，待測峰無雜質(zhì)干擾，峰形良好，分離度高，方法學(xué)考察結(jié)果顯示該方法重復(fù)性和準(zhǔn)確性均滿足要求。

綜上所述，本研究中建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確、可靠，可用于安腸液的質(zhì)量控制。