賈羲，朱春勝

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

杜仲葉為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）的干燥葉，具有補肝腎、強筋骨之功，臨床常用于治療肝腎不足、頭暈目眩、腰膝酸軟、筋骨痿軟等［1］。杜仲葉中主要含苯丙素類、黃酮類和木脂素類等化學成分［2-4］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，杜仲葉具有降血壓、降血脂、降血糖、抗炎和抗氧化等功效［5-7］。此外，有研究表明抗氧化作用可能是杜仲葉發(fā)揮補肝腎、強筋骨、抗衰老功效密切相關的藥理活性［8-9］。因此，進一步明確杜仲葉抗氧化活性成分對深入詮釋杜仲葉發(fā)揮補肝腎功效的活性成分及其在臨床中進一步深入開發(fā)具有重要意義。

氧化損傷是許多疾病和衰老的特征，包括與年齡相關的疾病，如糖尿病、癌癥、免疫性疾病和心血管疾病等［10-11］。大量研究表明，抗氧化劑可延緩氧化應激反應，而部分文獻報道了中藥具有較好的抗氧化、抗衰老活性，因此，從中藥中分離抗氧化劑是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制抗氧化新藥的重要途徑，同時也是闡明中藥抗衰老作用機制的關鍵。1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）自由基作為常用的抗氧化篩查劑，一旦與抗氧化劑接觸，便可接收抗氧化劑中的電子和質(zhì)子，進而引起DPPH 自由基紫色消退，導致其在特定波長處吸收減?。?2］。基于此，本研究將建立HPLC－DPPH 在線篩選系統(tǒng)，快速篩選杜仲葉提取物中的抗氧化活性成分；結(jié)合HPLC－DPPH 在線檢測及制備高效液相色譜純化技術(shù)開展杜仲葉抗氧化活性成分導向分離，同時在此基礎上結(jié)合分子對接技術(shù)和DPPH 體外實驗進一步驗證上述成分抗氧化活性，為杜仲葉的深入研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1200 型液相色譜（Agilent Technologies）；艾杰爾P2010 型液相色譜（博納艾杰爾科技）；制備型高效液相色譜（江蘇漢邦科技）；色譜柱ODS C18（江蘇漢邦科技）；AV Ⅲ－600 核磁共振儀（Bruker，Rheinstetten）；甲醇、石油醚（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；DPPH（Sigma－Aldrich）。

杜仲葉購自于安徽省亳州藥材市場，經(jīng)河南省鄭州市鄭州大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)藥學部王娟主任藥師鑒定為杜仲葉。

1.2 提取與分離

杜仲葉用70%乙醇，在70 ℃條件下回流提取3次，每次提取2 h。將提取液經(jīng)減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥得到杜仲葉提取物。之后，將杜仲葉提取物進一步使用AB－8 大孔樹脂色譜進行分離，依次使用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脫，收集水組分并進一步分離其中的抗氧化成分。

1.3 HPLC－DPPH篩選

應用在線HPLC－DPPH 結(jié)合二維液相色譜篩選杜仲葉提取物經(jīng)AB－8 分離后所得水組分中的抗氧化成分。實驗中應用DPPH 濃度為50 μg/mL，DPPH 流速為0.5 mL/min，反應線圈長度為15.0 m。樣品用ODS C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）進行分析，流動相為甲醇－水體系，30%～70%甲醇梯度洗脫30 min。根據(jù)樣品與DPPH 反應后吸收變化，檢測到了5個主要倒峰，見圖1。之后通過制備型高效液相色譜分離得到5個倒峰所對應的組分1～5。

圖1 杜仲葉HPLC－DPPH篩選

1.4 色譜分離

應用制備型液相色譜，使用ODS C18 反相色譜柱（20 mm×250 mm，10 μm）純化，流動相為甲醇－水體系，梯度洗脫：10%～60%甲醇，100 min，收集Fr1～Fr5共5 個組分。分別經(jīng)制備型液相色譜進一步純化，純化條件為Fr1∶25 %甲醇等度洗脫30 min；Fr2∶25%甲醇等度洗脫30 min；Fr3∶35%甲醇等度洗脫30 min；Fr4∶35%甲醇等度洗脫30 min；Fr5∶55%甲醇等度洗脫30 min。最終從杜仲葉粗提物經(jīng)AB－8大孔樹脂色譜分離所得水組分中得到5個抗氧化活性化合物。

1.5 分子對接實驗

從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫獲得超氧化物歧化酶SOD（PDB，ID：3RE0）三維結(jié)構(gòu)，應用Autodock vina 1.1.2進行分子對接，根據(jù)文獻［13］選取酶活性位點，設置Spacing（angstrom）為1.000，坐標為size_x=14，size_y=14，size_z=14；center_x=1.346，center_y=－3.077，center_z=30.651；exhaustiveness 為20；其他參數(shù)均為默認值。

1.6 DPPH體外實驗

參考文獻［14］，配制不同質(zhì)量濃度的待測樣本溶液（5 種單體），取2 mmol/L 的DPPH 溶液2 mL 為實驗組，對照組選用2 mL 無水乙醇代替DPPH 溶液，空白組選用2 mL 無水乙醇和2 mL 待測樣本，充分振蕩混勻，避光反應30 min，517 nm 處測其吸光度值，以上實驗重復3 次。計算抑制率分析各單體抗氧化活性。

抑制率（%）=［1－（D實驗－D空白）/D對照］×100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

通過1H－NMR 和13C－NMR 闡明了這5 種化合物的化學結(jié)構(gòu)，分別鑒定為兒茶素（1）、綠原酸（2）、咖啡酸（3）、山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷（4）和槲皮素（5），各化合物結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 杜仲葉中抗氧化成分結(jié)構(gòu)

2.1.1 化合物1

分子式：C15H14O6，白色粉末，1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6，δ，ppm，J/Hz）δ：6.86（1H，s，H－2′），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H－6′），6.73（1H，d，J=8.0 Hz，H－5′），6.03（1H，d，J=2.0 Hz，H－6），5.87（1H，d，J=2.0 Hz，H－8），4.58（1H，d，J=7.6 Hz，H－2），4.00（1H，m，H－3），2.84（1H，dd，J=16.4，5.6 Hz，H－4a），2.50（1H，dd，J=16.4，8.4 Hz，H－4b）；13C－NMR（150 MHz，DMSO－d6，ppm）δ：82.8（C－2），68.8（C－3），28.5（C－4），157.1（C－5），95.8（C－6），157.2（C－7），96.0（C－8），156.9（C－9），100.5（C－10），132.2（C－1′），115.5（C－2′），146.0（C－3′），146.0（C－4′），115.8（C－5′），120.5（C－6′）。以上化合物信息與文獻［15］報道較一致，鑒定為兒茶素。

2.1.2 化合物2

分子式：C16H18O9，白色粉末，1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6，δ，ppm，J/Hz）δ：1.90－2.10（4H，m，H－2a，2b，6a，6b），3.61（1H，dd，J=3.0，8.4 Hz，H－4），4.15（1H，m，H－3），5.05（1H，ddd，J=4.4，8.2，9.8 Hz，H－5），6.23（1H，d，J=16.0 Hz，H－8′），6.76（1H，d，J=8.2 Hz，H－5′），6.96（1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H－2′），7.03（1H，d，J=2.0 Hz，H－6′），7.45（1H，d，J=16.0 Hz，H－7′）；13C－NMR（150 MHz，DMSO－d6，ppm）δ：75.5（C－1），37.8（C－2），72.0（C－3），70.3（C－4），67.5（C－5），37.5（C－6），177.0（C－7），127.5（C－1′），115.7（C－2′），145.8（C－3′），148.8（C－4′），115.9（C－5′），123.1（C－6′），147.0（C－7′），115.0（C－8′），168.0（C－9′）。以上化合物信息與文獻［16］報道較一致，鑒定為綠原酸。

2.1.3 化合物3

分子式：C9H8O4，黃色粉末，1H-NMR（600 MHz，DMSO－d6，δ，ppm，J/Hz）δ：7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H－8），7.00（1H，d，J=2.4 Hz，H－2），7.03（1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H－6），6.75（1H，d，J=8.4 Hz，H－5），6.23（1H，d，J=16.0 Hz，H－7）；13C－NMR（150 MHz，DMSO－d6，ppm）δ：172.0（C－9），150.0（C－4），146.5（C－3），146.1（C－7），128.0（C－1），123.2（C－5），116.5（C－2），116.8（C－6），115.3（C－8）。以上化合物信息與文獻［17］報道較一致，鑒定為咖啡酸。

2.1.4 化合物4

分子式：C21H20O11，黃色粉末，1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6，δ，ppm，J/Hz）δ：12.65（1H，s，5－OH），8.00（2H，d，J=8.8 Hz，H－2′，6′），6.91（2H，dd，J=8.8 Hz，H－3′，5′），6.53（1H，d，J=2.0 Hz，H－8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H－6），5.45（1H，d，J=7.4 Hz，Glc－H－1）；13C－NMR（150 MHz，DMSO－d6，ppm）δ：157.1（C－2），134.2（C－3），178.2（C－4），162.1.（C－5），100.0（C－6），164.5（C－7），94.3（C－8），156.9（C－9），105.4（C－10），121.5（C－1′），131.3（C－2′，6′），115.0（C－3′，5′），160.5（C－4′），101.1（Glc－1），75.0（Glc－2），77.2（Glc－3），70.5（Glc－4），78.0（Glc－5），61.5（Glc－6）。以上化合物信息與文獻［18］報道較一致，鑒定為山柰酚－3－Oβ－D－葡萄糖苷。

2.1.5 化合物5

分子式：C15H10O7，黃色粉末，1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6，δ，ppm，J/Hz）δ：12.45（1H，s，5－OH），7.65（1H，d，J=2.0 Hz，H－2′），7.55（1H，dd，J=2.0，8.5 Hz，H－6′），6.93（1H，d，J=8.5 Hz，H－5′），6.40（1H，d，J=2.0 Hz，H－8），6.15（1H，d，J=2.0 Hz，H－6）；13C－NMR（150 MHz，DMSO－d6，ppm）δ：176.1（C－4），164.2（C－7），161.2（C－5），156.5（C－9），148.0（C－4′），145.5（C－2），145.0（C－3′），136.1（C－3），122.4（C－1′），120.5（C－6′），115.3（C－2′），115.0（C－5′），104.1（C－10），98.0（C－6），93.5（C－8）。以上化合物信息與文獻［19］報道較一致，鑒定為槲皮素。

2.2 分子對接結(jié)果

將5 個化合物對接至SOD 的疏水性腔袋。5 種化合物與SOD 的結(jié)合能分別為兒茶素：-6.3 kcal/mol、綠原酸：-5.4 kcal/mol、咖啡酸：-4.8 kcal/mol、山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷：-6.4 kcal/mol、槲皮素：-5.9 kcal/mol，其中兒茶素和山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷的結(jié)合能最大。見表1。

表1 5種化合物與SOD的分子對接結(jié)果

兒茶素與SOD 在活性口袋形成疏水性相互作用，通過分析，兒茶素與SOD 上的氨基酸殘基Ile 151、Arg 115、Ile 113、Cys 111、Leu 106、Gly 108、Ser 107、Asp109、Ala 1之間有π－陽離子相互作用；其中兒茶素上的－OH與Arg 115上的兩個氨基分別作用形成氫鍵相互作用，氫鍵鍵長分別為2.62 ?，2.04 ?。π－陽離子相互作用及氫鍵相互作用使得兒茶素與SOD的相互作用更加穩(wěn)定。山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷結(jié)合至SOD 的疏水活性口袋，其于SOD 之間形成疏水相互作用。結(jié)果見圖3。山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷與疏水口袋結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基Ile 151、Ile 113、Ala 1、Leu 106、Ser 107、Asp109、Gly 108、Cys 111、Arg 115之間有π－陽離子相互作用；山柰酚-3－O－β－D－葡萄糖苷上的3個羥基分別與SOD上的氨基酸殘基GLY 108（氨基）、Gly 108（羰基）和Arg 115（氨基）形成氫鍵作用，鍵長分別為2.09 ?、2.33 ?、2.66 ?。這些相互作用使得化合物與SOD之間形成穩(wěn)定的相互作用。結(jié)果見圖4。

圖3 兒茶素對接至SOD疏水口袋示意圖

圖4 山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷對接至SOD疏水口袋示意圖

2.3 DPPH自由基清除率檢測

杜仲葉中化合物1～5體外DPPH自由基清除率檢測結(jié)果見表2，5 個化合物對DPPH 自由基的清除能力由大到小依次為山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷、兒茶素、槲皮素、咖啡酸和綠原酸。

表2 化合物1～5的體外DPPH自由基清除率檢測結(jié)果

3 討論

中醫(yī)藥是中華民族幾千年智慧的結(jié)晶，有其獨特的理論體系，但中藥物質(zhì)基礎不清晰一直是制約中藥走向國際化的一個重要瓶頸。目前，國內(nèi)外常用的中藥物質(zhì)基礎研究方法是植化分離法，通過提取、分離及質(zhì)譜信息，明晰其結(jié)構(gòu)，并在此基礎上結(jié)合藥理模型對純化后的成分進行相應的藥效驗證，該方法為闡明中藥物質(zhì)基礎起到了積極的推動作用［20－21］。然而，上述方法不能較好地反應中藥多成分共同發(fā)揮藥效的特點，難以體現(xiàn)中醫(yī)藥特色——整體觀念。而在線快速篩選為闡明中藥藥效物質(zhì)基礎提供了強有力的手段，具有縮短分析時間、減少有機溶劑消耗、體現(xiàn)中藥多成分協(xié)作等優(yōu)勢［22－23］，已在基礎研究中獲得了廣泛認可。本研究應用AB－8 大孔樹脂色譜進行分離，并結(jié)合HPLC－DPPH 在線快速篩選方法，靶向分離杜仲葉中的抗氧化活性成分，水組分共分離得到5 個化合物，包括3個酚類化合物和2個黃酮類化合物，分別鑒定為兒茶素（1）、綠原酸（2）、咖啡酸（3）、山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷（4）和槲皮素（5）。

分子對接技術(shù)是評估化合物配體與蛋白質(zhì)靶標之間結(jié)合效率的強大工具，為中藥的物質(zhì)基礎篩選提供了強有力的支撐［24］。本次研究結(jié)合分子對接技術(shù)對上述分離的5 個成分與SOD 進行了篩選，發(fā)現(xiàn)兒茶素和山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷的與SOD 的結(jié)合能最大，分別為-6.3、-6.4 kcal/mol，主要原因可能與二者與SOD 形成較多的氫鍵及與SOD 上氨基酸殘基形成的π－陽離子相互作用有關。分子對接結(jié)果與DPPH 自由基清除率檢測較一致，其中山柰酚－3－O－β－D－葡萄糖苷和兒茶素對DPPH 自由基清除率最強。石艷賓等［25］在研究金銀花抗氧化成分時，以DPPH 自由基清除效果為衡量指標，發(fā)現(xiàn)槲皮素清除DPPH 能力較綠原酸強，與本實驗結(jié)果一致。綜上，本研究豐富了杜仲葉抗氧化活性成分，同時亦為杜仲葉的深入開發(fā)提供了依據(jù)。