葉慧，郝曉蓓，汪旭，徐桂華，楊敏，潘婭嵐，王慶，許悅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

骨髓抑制是放化療后常見且嚴(yán)重的不良反應(yīng)，具體表現(xiàn)為患者白細(xì)胞、血小板和血紅蛋白等血細(xì)胞減少，影響放化療療效和預(yù)后［1］，目前尚缺乏針對(duì)性的理想治療藥物。近年來，中醫(yī)藥在緩解骨髓抑制中的有效性日益凸顯，大量研究驗(yàn)證了不同中醫(yī)藥手段對(duì)其的療效［2］。扶正補(bǔ)血牛筋食療方是依據(jù)經(jīng)典方當(dāng)歸補(bǔ)血湯與課題組“扶正食療方”［3］，結(jié)合中醫(yī)“精氣血”互生理論所研發(fā)的中醫(yī)食療方，由當(dāng)歸、黃芪、黃精、牛蹄筋等中藥材與食材組成，具有益氣養(yǎng)血填精、固本培元的功效?；诖?，本研究采用5－氟尿嘧啶（5－Fluorouracil，5－Fu）誘導(dǎo)大鼠化療后骨髓抑制模型，探討扶正補(bǔ)血牛筋食療方治療骨髓抑制的作用，為臨床應(yīng)用中醫(yī)食療方改善骨髓抑制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只，8 周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自上海杰斯捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物中心，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2018－004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：2018000402381。大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，喂養(yǎng)期間自由飲水、攝食，室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。本研究已經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：201910A018）。

1.2 藥品

1.2.1 扶正補(bǔ)血牛筋食療方制備

參照當(dāng)歸補(bǔ)血湯配比、黃精與黃芪作用的最佳配比［4］及前期課題基礎(chǔ)［5］，確定當(dāng)歸∶黃芪∶黃精∶牛筋質(zhì)量比例為1∶5∶2∶40。根據(jù)當(dāng)歸補(bǔ)血湯人體用藥量（36 g/60 kg）［6］和動(dòng)物與人之間等效劑量換算［7］得到扶正補(bǔ)血牛筋食療方的大鼠臨床等效劑量為5.04 g/kg，2倍劑量為10.08 g/kg。

制備過程：①取牛蹄筋一根（約800 g）洗凈切塊，放入普通常壓鍋中，加入適量水，大火煮沸，撈出洗凈浮沫后置回鍋內(nèi)。加入1 800 mL清水，旺火煮沸后改用文火熬制2.5 h。②取當(dāng)歸20 g，黃芪100 g，黃精40 g，加3 倍量水浸泡0.5 h 后加入牛筋湯內(nèi)，先大火煮沸10 min，后改文火煎50 min。見牛筋軟爛，湯汁呈濃稠黃色，即可出鍋，置4 ℃過夜。③棄去上層油脂，解凍，過濾，旋蒸濃縮。將扶正補(bǔ)血牛筋食療方按劑量濃縮成0.504 g/mL 的常規(guī)生藥濃度（低劑量組）與1.008 g/mL的2倍劑量高濃度（高劑量組），分裝后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單純牛筋湯的制備

800 g 牛蹄筋洗凈斬塊，放入普通常壓鍋中，加入適量水，大火煮沸，撈出洗凈浮沫后置回鍋內(nèi)。加入1 800 mL 清水，旺火煮沸后改用文火熬制2.5 h。見牛筋軟爛，湯汁呈乳白色，即可出鍋，置4 ℃過夜。棄去上層油脂，解凍，過濾，旋蒸濃縮。濃縮制成與高劑量食療方同樣濃度的牛筋湯，分裝后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 鯊肝醇混懸液

按照12 mg/（mL·d）的濃度配制鯊肝醇溶于阿拉伯膠的混懸液［8］，混勻后分裝，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：5－氟尿嘧啶（美國Sigma－Aldrich 公司，批號(hào)：WXBD1215V）；鯊肝醇（美國CSNpharm公司，批號(hào)：CSN10379－002）；蘇木素、伊紅（武漢谷歌生物科技有限公司）；無水乙醇、二甲苯（上海久億化學(xué)試劑有限公司）。

主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)：RE－52A，上海研承儀器有限公司）；小動(dòng)物麻醉機(jī)（型號(hào)：R500IP，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；VetScan HM5 動(dòng)物血細(xì)胞分析儀（型號(hào)：06/2014，美國ABAXIS）；脫水機(jī)（型號(hào)：JJ－12J，武漢俊杰電子有限公司）；石蠟包埋機(jī)（型號(hào)：JB－P5，武漢俊杰電子有限公司）；石蠟超薄切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：Nikon Eclipse CI，日本尼康）。

1.4 動(dòng)物模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，48 只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組8只和造模組40只。造模組參考文獻(xiàn)［9］及試劑說明書，按150 mg/kg 劑量尾靜脈注射5－氟尿嘧啶（用生理鹽水稀釋至10%濃度）造模?？瞻捉M尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.5 分組及給藥

造模成功的40 只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組（僅造模）、陽性對(duì)照組（造模后給予鯊肝醇）、單純牛筋湯組（DN組，給予單純牛筋湯）、扶正補(bǔ)血牛筋食療方低劑量組（FZBXN－L組，給藥劑量為0.504 g/mL）、扶正補(bǔ)血牛筋食療方高劑量組（FZBXN－H組，給藥劑量為1.008 g/mL），每組8 只，各組大鼠均給予普通飼料。造模成功后14 d內(nèi)，各組每天定時(shí)灌胃，灌胃前溶液復(fù)溫至37 ℃左右，灌胃量1 mL/100 g，同樣條件下正常組和造模組灌胃等量生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測

于造模后24 h 和第5、10、15 天，對(duì)空白組、模型組大鼠進(jìn)行眼眶取血，采用血細(xì)胞分析儀分別檢測外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)與血紅蛋白（HGB）含量。造模后第15 天，對(duì)各組大鼠進(jìn)行眼眶取血，并檢測外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.6.2 免疫器官指數(shù)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，迅速摘取胸腺，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)。

胸腺指數(shù)（%）=胸腺重量（g）/ 大鼠體重（g）×100%

1.6.3 骨髓病理檢查與脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)

快速取各組大鼠的股骨和脾臟，新鮮組織于4%多聚甲醛中固定24 h 以上，進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色。將骨髓病理切片置顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并拍照，同時(shí)在鏡下進(jìn)行脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)變化，采用重復(fù)測量方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)各組之間的血細(xì)胞計(jì)數(shù)變化、脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)、胸腺指數(shù)的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett′s T3 檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5－氟尿嘧啶誘導(dǎo)骨髓抑制模型大鼠的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況

動(dòng)物造模后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)大致呈下降的趨勢，其中WBC、PLT、HGB 經(jīng)一定時(shí)間干預(yù)后有恢復(fù)趨勢。WBC、PLT、HGB 在開始注射5－Fu 后第10天左右降到最低值，并在造模后15 d向模前水平趨近，造模后RBC呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。見圖1。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用尾靜脈注射5－Fu方法制備化療后骨髓抑制模型，可以導(dǎo)致WBC、RBC、PLT、HGB 計(jì)數(shù)同時(shí)降低，提示造模成功。

圖1 造模后大鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的經(jīng)時(shí)變化

2.2 各組大鼠外周血象檢測結(jié)果比較

干預(yù)結(jié)束后，與空白組比較，5－Fu 能顯著降低外周血中WBC、RBC、HGB（P＜0.05，P＜0.01），PLT 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，陽性對(duì)照組外周血的WBC、RBC、PLT、HGB 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。DN 組可以顯著提升WBC 計(jì)數(shù)（P＜0.05），對(duì)RBC、PLT、HGB 存在一定升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FZBXN－L 組對(duì)促進(jìn)WBC、PLT 升高有明顯作用（P＜0.05，P＜0.01），對(duì)升高RBC、HGB 計(jì)數(shù)有一定優(yōu)勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FZBXN－H 組對(duì)提升WBC、RBC、PLT、HGB 數(shù)量有顯著作用（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)情況比較（±s）

表1 各組大鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)情況比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

HGB（g/L）177.13±3.44 144.25±12.24##164.00±8.94**151.13±4.22 149.00±10.28 158.63±8.85**組別空白組模型組陽性對(duì)照組DN組FZBXN－L組FZBXN－H組n8 8 8 8 8 8 WBC（109/L）8.71±2.11 5.95±2.22#10.33±1.83**9.50±2.84*9.62±2.33**9.86±3.94**RBC（1012/L）6.39±0.18 4.49±0.37##5.49±0.62*5.08±0.39 4.80±0.59 5.15±0.03*PLT（109/L）702.88±49.59 923.75±531.79 1 329.88±373.74*1 207.25±151.07 1 254.38±217.03*1 297.63±200.25*

2.3 各組大鼠脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)、胸腺指數(shù)檢測結(jié)果比較

造模后第15 天，模型組大鼠的脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)與胸腺指數(shù)顯著低于空白組（P＜0.01，P＜0.05）。相比模型組，陽性對(duì)照組、DN 組、FZBXN－L 組、FZBXN－H 組大鼠脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)均顯著提升（P＜0.01，P＜0.05），并以高劑量扶正補(bǔ)血牛筋食療方的改善作用更為明顯。陽性對(duì)照組、FZBXN－L 組可以顯著提升大鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05），DN 組胸腺指數(shù)也有所增加，但與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)、胸腺指數(shù)的比較

2.4 各組大鼠骨髓組織形態(tài)學(xué)比較

光鏡下觀察空白組的細(xì)胞分布均勻且排列緊密，骨髓組織增生明顯活躍，造血組織占比高，脂肪組織占比少，巨核細(xì)胞清晰；模型組的骨髓組織增生減退，造血組織較空白組顯著減少，脂肪組織占比上升，巨核細(xì)胞顯著減少；陽性組的骨髓組織增生極度活躍，造血組織較模型組顯著提升，且脂肪組織占比小于10%，巨核細(xì)胞明顯增多；DN 組、FZBXN－L 組和FZBXN－H 組的骨髓組織均增生活躍，造血組織占比較模型組顯著提升，脂肪組織占比減少，巨核細(xì)胞增多。見圖3。

圖3 各組大鼠骨髓組織病理檢查結(jié)果的比較（HE染色，×200）

3 討論

作為人體主要的造血器官，骨髓為維持造血細(xì)胞行使其分裂增殖、分化造血、遷出歸巢等一系列功能提供了生態(tài)位［10-11］。有研究表明，化療藥物能通過誘導(dǎo)造血干細(xì)胞（HSCs）老化，抑制其自我更新與復(fù)制，引起骨髓基質(zhì)細(xì)胞與相關(guān)血液循環(huán)產(chǎn)生過度應(yīng)激反應(yīng)，并損傷造血微環(huán)境，最終促使骨髓抑制的發(fā)生［12-14］。骨髓抑制是癌癥治療中最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重限制了抗腫瘤治療的耐受性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常采用注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G－CSF）、促紅細(xì)胞生成刺激劑（ESA）和促血小板生成素（THPO），成分輸血、造血干細(xì)胞移植，口服升白細(xì)胞藥物（如鯊肝醇）等手段進(jìn)行治療，且取得了一定的療效［15］；但這些治療手段還存在藥物作用單一、具有潛在排異反應(yīng)與感染風(fēng)險(xiǎn)、需反復(fù)用藥、療效欠佳、治療費(fèi)用高昂等不足之處。

中醫(yī)藥方法在防治骨髓抑制方面療效顯著，且具有毒副作用小、價(jià)格相對(duì)低廉等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的患者所接受［16］。骨髓抑制屬“血虛”“虛勞”“虛損”范疇，臨床治療主要以補(bǔ)虛、補(bǔ)氣、補(bǔ)血的中藥為主［17］。精、氣、血三者互生互化，維持機(jī)體的平衡。扶正補(bǔ)血牛筋食療方的組方配伍遵循中醫(yī)“精氣血互生”和藥食同源理論，由當(dāng)歸補(bǔ)血湯加黃精與牛蹄筋配伍而成，包含當(dāng)歸、黃芪、黃精和牛蹄筋。其中當(dāng)歸具有補(bǔ)血和血之效，其主要成分可升高骨髓抑制小鼠血清中IgG、IgM含量，緩解不同程度骨髓抑制［18］，拮抗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老［19］；黃芪補(bǔ)中益氣，可以促進(jìn)HSCs增殖［20］、延緩HSCs 衰老［21］；黃精健脾益精，有促進(jìn)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)、改善造血器官、促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的作用［22-23］；牛蹄筋既是食物也是藥材，入肝經(jīng)，味甘性涼，為血肉有情之品，善補(bǔ)氣血，被清代《本草從新》記載具有“補(bǔ)肝強(qiáng)筋，益氣力，續(xù)絕傷”之效，有研究證明牛肉湯劑應(yīng)用于腦缺血模型大鼠，可以減少腦缺血大鼠的腦梗死體積，調(diào)節(jié)外周免疫抑制，改善腦缺血大鼠受損的神經(jīng)功能［24-26］。當(dāng)歸、黃芪、黃精和牛蹄筋四者配伍共奏益氣養(yǎng)血填精、固本培元之功。

5－Fu 是目前常用的廣譜抗癌化療藥物，其治療作用機(jī)制為抑制胸苷酸合成酶，并將其代謝物摻入RNA 和DNA，破壞RNA 合成、導(dǎo)致DNA 片段化，從而使癌細(xì)胞凋亡或壞死［27］。5－Fu 在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)造血系統(tǒng)有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射5－Fu制備大鼠骨髓抑制模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后，鼠外周血WBC、PLT、HGB 數(shù)量均呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)趨勢，且在第10 天左右降至最低點(diǎn)，RBC 呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。表明5－Fu 能使外周血象受到抑制，與骨髓抑制的臨床表現(xiàn)一致。

外周血象的改變是骨髓抑制的直接體現(xiàn)，本研究結(jié)果顯示，扶正補(bǔ)血牛筋食療方對(duì)受抑制的大鼠外周血象有明顯的改善作用，其中以高劑量組提升全血細(xì)胞效果最佳，提升效果接近或超過陽性藥物組。低劑量食療方可以顯著提升WBC、PLT 計(jì)數(shù)，單純牛筋湯可顯著提升WBC 計(jì)數(shù)，兩者對(duì)整體外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)均存在一定改善趨勢。脾、胸腺和骨髓同屬機(jī)體的免疫器官，對(duì)建立正常免疫功能和修復(fù)受損的免疫功能起重要作用［28］。脾儲(chǔ)存血液，可調(diào)節(jié)循環(huán)血量和骨髓造血功能，維持血細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。骨髓具有特異性靶向性及放化療敏感性，通過分化干細(xì)胞參與血細(xì)胞的形成和受損造血器官的修復(fù)［29］。本研究結(jié)果顯示，扶正補(bǔ)血牛筋食療方與單純牛筋湯可以顯著提升脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)，提示其對(duì)于受損的脾功能有改善作用，其中以高劑量食療方效果最佳；低劑量食療方表現(xiàn)出對(duì)胸腺指數(shù)的顯著改善作用；骨髓病理檢查結(jié)果還提示扶正補(bǔ)血牛筋食療方與單純牛筋湯有助于使骨髓造血面積回升、提升骨髓造血細(xì)胞數(shù)量。以上結(jié)果提示，扶正補(bǔ)血牛筋食療方對(duì)骨髓抑制大鼠的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)有直接改善作用，對(duì)重要的免疫器官、造血器官損傷有一定修復(fù)作用，且單純牛筋湯也展示出較好效果。

綜上，扶正補(bǔ)血牛筋食療方對(duì)大鼠骨髓抑制具有一定的治療作用，可顯著改善5－Fu誘導(dǎo)化療后骨髓抑制模型大鼠的骨髓造血功能。其作用機(jī)制可能與修復(fù)脾和胸腺等免疫和造血器官，改善骨髓造血微環(huán)境，并提升外周血中血細(xì)胞數(shù)量等有關(guān)。對(duì)于食療方作用靶點(diǎn)、分子層面的作用機(jī)制和相關(guān)通路仍需進(jìn)一步探究。