朱穎 黃建峰 張勤 高敏 文昱婷 武良權 蔡偉 張允雷 張秀偉

現(xiàn)階段臨床上肺結節(jié)的良惡性辨別以及跟蹤監(jiān)測主要依賴于低劑量螺旋CT和穿刺活檢。但是在影像學上觀察到惡性肺結節(jié)時，少數(shù)肺癌的癌干細胞已經成功侵入機體的其他器官，導致肺癌的發(fā)生[1]。大規(guī)模的臨床呼吸道樣本微生物16s測序結果表明，微生物的α多樣性和分布(均勻度) 在非惡性肺組織中明顯高于腫瘤肺組織[2]。然而，與健康人群相比，癌癥病例中的幾個微生物分類群已被證明是相當豐富的。這些存在于肺癌組織中的定植菌，主要包括 流感嗜血桿菌、 腸桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌(G-)[3]。肺癌病人的顆粒桿菌、營養(yǎng)缺陷菌屬和鏈球菌屬的豐度明顯高于健康人群[4]。更重要的是，肺泡灌洗液中的巨球型菌屬、二氧化碳噬細胞菌屬、硬壁菌門和韋榮球菌屬細菌在預測肺鱗癌和肺腺癌方面已經顯示出較高的AUC值，可以被用作肺癌的生物標志物[5]。雖然這些研究結果具有明顯的地域性，不同國家和地區(qū)的研究結果差別較大。但是，上述研究充分說明痰液和肺泡灌洗液中的微生物中包含著肺癌的“蛛絲馬跡”。因此，本研究擬在痰液和肺泡灌洗液的一般細菌涂片檢查的結果中探究一種簡便快捷、適合老年病人的肺結節(jié)良惡性辨別方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年5月在南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院初次就診的94例老年肺癌病人和36例老年肺結節(jié)病人為研究對象。納入標準：年齡>65歲；初次確診為肺癌或肺結節(jié)。排除標準：呼吸道感染和其他惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病病人等。將120例病人分為肺結節(jié)組(n=26)和肺癌組(n=94)，肺癌組又分為肺腺癌組(n=38)和肺鱗癌組(n=56)。肺結節(jié)組男19例，女17例，年齡65～76歲，平均(67.14 ± 7.81)歲，其中患有肺部基礎性疾病者共17例(主要包括慢性支氣管炎3例、COPD 4例、慢性支氣管炎合并COPD 5例、慢性支氣管炎合并肺氣腫3例和陳舊性肺結核2例)；肺腺癌組男23例，女15例，年齡66～79歲，平均(67.34 ± 9.59)歲，臨床分期(第八版臨床肺癌分期)為Ⅰ期的病人共12例，Ⅱ期及以上病人共26例，其中患有肺部慢性疾病的病人共7例(主要包括慢性支氣管炎1例、COPD 1例、肺氣腫2例、陳舊性肺結核1例、慢性支氣管炎合并肺氣腫1例和慢性支氣管炎合并COPD 1例)。肺鱗癌組男47例，女9例，年齡69 ～79歲，平均(68.63 ± 7.24)歲，臨床分期為Ⅰ期病人共13例，Ⅲ期病人共27例，Ⅳ期病人共16例，其中患有肺部慢性疾病的病人25例(主要包括慢性支氣管炎3例、COPD 6例、肺氣腫5例、陳舊性肺結核3例、慢性支氣管炎合并肺氣腫5例和慢性支氣管炎合并COPD 3例)。3組病人一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 歸類富集相關病例：按照上述研究對象的篩選標準，利用醫(yī)院醫(yī)療數(shù)據(jù)庫，通過相關代碼歸類富集相關病例，如肺結節(jié)(代碼：R91.X04)，肺腺癌(代碼：C34.908)，肺鱗癌(代碼：C34.907)，一般細菌涂片(編碼：250501001)和細菌真菌培養(yǎng)、鑒定(編碼：250501009-b)。其中，一般細菌涂片帶有白細胞和上皮細胞檢測的為痰液檢查，其他的為肺泡灌洗液檢查。

1.2.2 涂片檢查：痰液、肺泡灌洗液的一般涂片檢查：首先，取病人適量的肺泡灌洗液600～1000 r/min 離心10～20 min，取離心沉淀物進行革蘭氏染色質量評估，剩余肺泡灌洗液于1500～1800 r/min離心15～20 min，用接種環(huán)蘸取離心沉淀物，在玻片中央均勻地涂布成薄層。對于病人痰液，利用接種環(huán)直接蘸取后涂布于玻片中央。玻片自然干燥后，置于酒精燈火焰上方加熱固定，進行常規(guī)革蘭氏染色和抗酸染色。

1.2.3 觀察指標：記錄3組病人的痰液和肺泡灌洗液中一般細菌涂片的革蘭氏陽性菌(G+)、G-、抗酸桿菌和真菌的相對數(shù)量，同時記錄痰液中主要的微生物培養(yǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0軟件處理，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺結節(jié)和肺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結節(jié)病人在少量G-、少量G+和大量G+檢出率上與肺癌病人比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 肺結節(jié)和肺腺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結節(jié)病人中大量G+的檢出率更高(P<0.05)；肺腺癌病人中大量G-的檢出率更高(P<0.05)。見表1。

2.3 肺結節(jié)和肺鱗癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結節(jié)病人痰液中少量G-、大量G+病原菌菌群檢出率顯著高于肺鱗癌病人(P<0.01)；肺鱗癌病人中少量G+病原菌菌群檢出率更高(P<0.05)。見表1。

表1 病人痰液中主要病原菌的診斷結果比較(n,%)

2.4 肺結節(jié)和肺癌病人的痰液中主要微生物培養(yǎng)結果比較 26例肺結節(jié)病人的痰液中，共有2例(7.69%)病人培養(yǎng)出白色假絲酵母菌；肺腺癌和肺鱗癌病人中分別有16例(42.11%)和8例(14.2%)培養(yǎng)出微生物。見表2。

表2 老年肺癌與肺結節(jié)病人痰液中主要微生物培養(yǎng)結果(n,%)

2.5 肺結節(jié)和肺癌病人的肺泡灌洗液細菌檢出率比較 肺泡灌洗液一般細菌涂片結果表明，病原菌在肺結節(jié)、肺腺癌、肺鱗癌和肺癌(包含肺腺癌和肺鱗癌)病人中的檢出率分別為11.54%、34.21%、33.90%和34.05%，肺癌病人的肺泡灌洗液一般細菌涂片的細菌檢出率顯著高于肺結節(jié)病人(P<0.05)。見圖1。

圖1 肺泡灌洗液一般細菌涂片檢測細菌檢出率

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展非常隱蔽，很多病人在早期并無不適癥狀[6]。肺癌的篩查主要借助于胸部低劑量螺旋CT，其特殊的肺部影像學特征可以快速判斷肺部腫瘤的良惡性[7]。但是，部分肺癌病人的CT影像學特征與肺結節(jié)相似，特別是早期肺癌病人有相當一部分表現(xiàn)為肺結節(jié)，需要穿刺等有創(chuàng)診斷來協(xié)助確診[8-9]。有創(chuàng)活檢是肺癌診斷的金標準，但是針對老年病人身體健康狀況、活檢取材位置和檢測周期較長等影響，一般老年肺結節(jié)病人很難接受這種檢查。隨著低劑量螺旋CT檢查在常規(guī)體檢中的普及，肺結節(jié)病人快速增加，而肺結節(jié)病人中有30%～40%最終發(fā)展為惡性肺結節(jié)[10]。目前的研究表明，每年進行1次低劑量螺旋 CT 不會對人體產生明顯的傷害。但是，低劑量螺旋 CT在肺癌篩查方面只有不到 30 年的歷史，且部分研究表明，低劑量螺旋CT會對血液細胞產生短暫的 DNA損傷[11]。更重要的是，盡管肺結節(jié)和肺癌的CT影像學特征顯著不同，但是部分病例仍無法通過影像學確診。因此，臨床上急需一種快捷無創(chuàng)的方法輔助辨別肺結節(jié)良惡性。新近研究表明，痰液和肺泡灌洗液中的微生物生態(tài)系統(tǒng)對肺癌的預測和診斷具有重要意義[1]。

本研究結果顯示，老年肺結節(jié)和肺癌病人在痰液和肺泡灌洗液的一般細菌涂片檢查結果上存在顯著性差異。在痰液的一般細菌涂片檢查中，肺結節(jié)病人在少量G-和大量G+檢出率顯著高于肺癌病人，而少量G+檢出率顯著低于肺癌病人，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明一般痰液涂片檢查具有辨別肺結節(jié)良惡性的潛力。當肺結節(jié)病人與肺鱗癌病人進一步比較時，其結果與肺癌病人一致。但是，肺腺癌病人與肺結節(jié)病人比較時，大量G-和大量G+檢出率差異有統(tǒng)計學意義，而少量G-和少量G+檢出率沒有差異。進一步的痰液細菌真菌培養(yǎng)結果表明，肺腺癌和肺鱗癌病人共培養(yǎng)出了7種不同的微生物，而肺結節(jié)病人僅培養(yǎng)出了白色假絲酵母菌。肺腺癌病人痰液中的微生物具有不同于一般肺癌病人的特征，事實上，痰液、肺泡灌洗液和胸腔積液涂片細胞學檢查和痰液細胞DNA倍體定量分析等技術已經在肺癌診斷中被廣泛使用[12]。但是，這些檢測技術主要依賴于肺癌脫落的細胞，而中央型肺癌以及早期肺癌很難有脫落細胞被檢出。伴隨著人體微生物組學和測序技術的進步，痰液及肺泡灌洗液的16s測序已經在肺癌的早期診斷和良惡性辨別上顯示出重要的應用價值[13-14]。但是，人體微生物組學的研究結果具有較強的地域性，很難被推廣應用。更重要的是，這些研究結果只是證明了某些菌屬的種類或者豐度與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系，并沒有形成具有臨床價值的檢測產品。同時，臨床上的16s測序更多地用于肺部病原菌的確定，成本較高，周期較長。本研究基于痰液和肺泡灌洗的微生物病原菌，通過一般細菌涂片探究肺結節(jié)和肺癌病人的差異，具有比細胞學檢測可靠，比16s測序更簡便快捷的特點。

綜上所述，本研究證明了痰液和肺泡灌洗液的一般細菌涂片檢查和細菌真菌培養(yǎng)具有辨別老年肺結節(jié)良惡性的作用，這種檢查方法具有簡便、快速和經濟的特點，同時可以減少低劑量螺旋CT對老年病人的輻射傷害，具有重要的臨床應用價值。