樊垚 王強(qiáng) 唐吉宏 婁青林 唐偉 顧劉寶

T2DM是一種復(fù)雜的多基因多因素疾病。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者在分子水平探討T2DM的發(fā)病機(jī)制并關(guān)注其早期診斷及預(yù)防。大量全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWASs)發(fā)現(xiàn)，有240余個(gè)易感基因與T2DM或其并發(fā)癥有關(guān)[1]，然而這些易感基因只能解釋其中很小一部分原因[2-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)雜疾病中，除基因組序列變異外，表觀遺傳調(diào)控也起到重要作用，因此有必要對(duì)糖尿病相關(guān)的表觀遺傳學(xué)等分子機(jī)制進(jìn)行深入研究[4]。

研究表明，糖尿病是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，糖尿病病人心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病者增加2～4倍。DNA甲基化是一種重要的遺傳外修飾，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。850K芯片可以檢測(cè)人全基因組約853 307個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。本研究使用850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù)檢測(cè)老年T2DM病人外周血全基因組DNA甲基化修飾水平，旨在探討DNA甲基化修飾與老年T2DM病人心血管病死亡風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，并尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)，為早期防治糖尿病心血管并發(fā)癥提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象均來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院糖尿病分階段達(dá)標(biāo)管理(China Staged Diabetes Targeting Management，SDTM)項(xiàng)目注冊(cè)的T2DM病人。該項(xiàng)目為開(kāi)放式隊(duì)列隨訪研究，自2010年開(kāi)始招募入組對(duì)象，入組條件為簽署知情同意書(shū)且在本院就診的T2DM病人，病人均符合中國(guó)T2DM防治指南(2010年版)診斷標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病?？谱o(hù)士先對(duì)所有入組對(duì)象進(jìn)行電話訪談，以確認(rèn)每位病人的現(xiàn)狀，再通過(guò)當(dāng)?shù)丶膊】刂浦行南到y(tǒng)的居民數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有死亡數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究選取截至2017年12月底結(jié)局事件為心血管病死亡的病人12例為死亡組，年齡78～89歲，男10例，女2例。根據(jù)巢式病例對(duì)照設(shè)計(jì)，按照性別、年齡進(jìn)行1:1匹配，采用傾向性評(píng)分法，卡鉗值設(shè)置為0.02，最終從數(shù)據(jù)庫(kù)中選取截至2017年12月底仍存活的12例病人為非死亡組，年齡78～90歲，男8例，女4例。本研究已通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指標(biāo)檢測(cè)：入組時(shí)采集病人清晨空腹靜脈血4 mL，以分離膠促凝劑保存，4000 r/min離心10 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀(雅培c1600)檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、AST、ALT等生化指標(biāo)。

1.2.2 DNA提取：入組時(shí)采集病人清晨空腹靜脈血2 mL以EDTA抗凝，放置于-80 ℃冰箱凍存。使用德國(guó)Qiagen公司血液組織DNA提取試劑盒提取外周血DNA。

1.2.3 DNA甲基化水平檢測(cè)：入組時(shí)使用Illumina公司850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù)，委托上海晶能生物技術(shù)有限公司檢測(cè)基因組DNA甲基化程度。850K芯片針對(duì)每個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)2種探針，即signal A和signal B雙色熒光信號(hào)用于檢測(cè)非甲基化和甲基化的等位基因。使用R軟件minfi包對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，CpG位點(diǎn)的甲基化程度通過(guò)β值衡量，計(jì)算公式為：β=signal B/(signal A+signal B+100)。有效探針β值的區(qū)間為[0，1]，0表示該CpG位點(diǎn)無(wú)甲基化，1表示該CpG位點(diǎn)完全甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.3.2 基因組甲基化差異分析：使用Beta MIxture Quantile dilation(BMIQ)法對(duì)β值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用R語(yǔ)言的limma包建立線性模型并計(jì)算每個(gè)CpG位點(diǎn)的P值。采用Benjamini & Hochberg法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，根據(jù)校正后的P值進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的篩選。差異甲基化位點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，︱βdifferencecase-control︱>0.1。采用R語(yǔ)言的pheatmap包繪制差異甲基化位點(diǎn)基因的熱圖。

1.3.3 生物信息學(xué)分析：將篩選出的差異甲基化位點(diǎn)通過(guò)DAVID基因功能分析平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov)完成基因本體(gene ontology，GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路分析。采用Benjamini & Hochberg法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，以P<0.05為差異甲基化位點(diǎn)基因在該條GO條目和KEGG通路上顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 2組基線一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較 非死亡組HDL-C水平高于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他人口學(xué)特征、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)、疾病史和用藥史差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 DNA甲基化檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 Illumina Human Methylation 850 BeadChip芯片的評(píng)價(jià)：芯片在雜交、洗滌、掃描步驟質(zhì)控良好，使用BMIQ法對(duì)β值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，β值均位于[0，1]區(qū)間，表示探針有效，所有數(shù)據(jù)均可用于后續(xù)分析。

2.2.2 差異甲基化位點(diǎn)分析：根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異甲基化位點(diǎn)共303個(gè)。根據(jù)2組樣本在303個(gè)差異甲基化位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)繪制差異甲基化位點(diǎn)基因熱圖，見(jiàn)圖1。

注：Group A為非死亡組，Group B為死亡組；紅色為高甲基化，藍(lán)色為低甲基化圖1 差異甲基化位點(diǎn)基因熱圖

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 GO功能分析：GO功能可分為生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3個(gè)部分。計(jì)算每個(gè)GO條目中差異甲基化位點(diǎn)基因富集程度的P值，結(jié)果提示差異甲基化位點(diǎn)基因生物學(xué)功能富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞黏附分子、血糖穩(wěn)態(tài)和樹(shù)突發(fā)育正調(diào)控等生物過(guò)程；質(zhì)膜的組成成分、樹(shù)突和細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)細(xì)胞成分；鈣離子結(jié)合和序列特異性DNA結(jié)合分子功能。見(jiàn)圖2。

圖2 DNA差異甲基化位點(diǎn)基因參與的主要生物過(guò)程

2.3.2 通路分析(Pathway 富集分析)：計(jì)算每個(gè)KEGG通路條目中差異甲基化位點(diǎn)基因富集程度的P值。結(jié)果顯示，差異甲基化位點(diǎn)基因顯著富集在細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號(hào)通路和炎癥介質(zhì)對(duì)瞬時(shí)受體電位離子(transient receptor potential, TRP)通道的調(diào)節(jié)通路。見(jiàn)圖3。

圖3 DNA差異甲基化位點(diǎn)基因參與的主要信號(hào)通路

3 討論

有研究表明，約30%的T2DM病人有心血管并發(fā)癥，而70%的T2DM病人死因?yàn)樾难芗膊8]。本研究通過(guò)對(duì)老年T2DM心血管病死亡病人和非死亡病人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的全基因組甲基化芯片檢測(cè)，篩選出差異甲基化位點(diǎn)基因，初步為老年T2DM心血管病死亡風(fēng)險(xiǎn)的甲基化譜的建立奠定基礎(chǔ)。

TRP通道在多種心血管疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用[9]。TRPV1是哺乳動(dòng)物TRP離子通道7個(gè)亞家族之一。已有研究表明，TRPV1的缺失可能影響中性粒細(xì)胞的遷移，促使炎癥因子、趨化因子過(guò)度生成，造成心梗后炎癥過(guò)度活動(dòng)、不對(duì)稱心室重塑、心功能惡化[10]。TRPV1基因多態(tài)性與T2DM遺傳易感性及術(shù)中不良心血管事件的發(fā)生相關(guān)[11]。cAMP是胰高血糖素肽-1受體(glucogan like peptide-1 receptor，GLP-1R)的主要第二信使，其可活化一系列下游分子信號(hào)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等生物學(xué)作用[12]。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，胰高血糖素肽-1(glucogan like peptide-1，GLP-1)的心血管保護(hù)作用獨(dú)立于血糖和血清胰島素水平等因素之外[13]，發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與心臟和血管內(nèi)皮的GLP-1R相結(jié)合[14]。Flamez等[15]發(fā)現(xiàn)，GLP-1與胰島B細(xì)胞膜上受體相結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上升，導(dǎo)致細(xì)胞膜電生理變化從而刺激胰島素分泌。Dozier等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可通過(guò)cAMP/PKA通路抑制炎性反應(yīng)，從而改善脂多糖誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。Liu等[17]對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠予以2周西他列汀治療，發(fā)現(xiàn)大鼠的腎動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能有所改善，腎功能血流恢復(fù)，血壓降低，其機(jī)制可能是通過(guò)提高cAMP水平，從而進(jìn)一步激活蛋白激酶K(protein kinase A, PKA)、AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)等分子而發(fā)揮作用。以上研究均表明，cAMP/PKA是GLP-1發(fā)揮多器官保護(hù)作用的一個(gè)非常重要的分子通路。

細(xì)胞黏附分子在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、血栓形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究GO功能分析結(jié)果顯示，差異甲基化位點(diǎn)基因參與細(xì)胞黏附分子的生物學(xué)過(guò)程。季慧慧等[18]對(duì)T2DM病人和正常對(duì)照人群的DNA差異甲基化基因進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與細(xì)胞黏附分子生物過(guò)程。成淑英等[19]發(fā)現(xiàn)合并不同程度頸動(dòng)脈或下肢動(dòng)脈硬化的T2DM病人血清血管細(xì)胞黏附分子1水平顯著高于健康對(duì)照組。上述研究結(jié)果提示，DNA甲基化參與細(xì)胞黏附分子生物過(guò)程從而影響T2DM病人的心血管疾病進(jìn)展。

鈣離子結(jié)合在動(dòng)脈鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[20]。Liang等[21]的研究表明，鈣離子結(jié)合在糖尿病病人心血管疾病發(fā)展過(guò)程中被激活。結(jié)合本研究結(jié)果可以得出，DNA甲基化參與鈣離子結(jié)合分子功能從而影響T2DM病人的心血管疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾圖譜在老年T2DM病人心血管病死亡組與非死亡組中存在顯著差異，差異甲基化位點(diǎn)基因顯著富集在cAMP信號(hào)通路和炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)過(guò)程中，提示DNA甲基化作為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，可能通過(guò)參與以上生物學(xué)過(guò)程對(duì)T2DM病人心血管病死亡發(fā)揮一定作用。本研究采用850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù)，有較高的穩(wěn)定性，研究結(jié)果有一定參考價(jià)值。但由于本研究樣本量較小，同時(shí)缺少功能研究驗(yàn)證。因此，仍需更多研究來(lái)驗(yàn)證本結(jié)果的可靠性。