王為 趙蒙 李昀 殷宏宇

腦卒中后癲癇(post-stroke epilepsy，PSE)是缺血性腦卒中常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1]，可嚴(yán)重影響病人的神經(jīng)功能，導(dǎo)致預(yù)后不良[2]。外泌體是內(nèi)皮衍生的胞外囊泡，因其具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物學(xué)特性，已經(jīng)成為多種疾病最具潛力的生物標(biāo)志物之一。Lin等[3]基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，證實(shí)血清外泌體蛋白血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)在癲癇人群和健康人群中存在差異性表達(dá)。TSP-1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)的主要活化劑，也是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因子，可誘導(dǎo)受損組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的趨化反應(yīng)。從生理學(xué)上講，局灶性或全身性非調(diào)控的炎癥過(guò)程可導(dǎo)致神經(jīng)連接異常和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)超興奮，從而介導(dǎo)癲癇的發(fā)生[4]。本研究旨在分析TSP-1表達(dá)變化與PSE發(fā)生的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡述PSE的發(fā)生機(jī)制以及尋找臨床生物標(biāo)志物提供新的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究屬于單中心、前瞻性隊(duì)列研究，選取204例于2018年1月至2019年6月在我院急診就診的老年缺血性腦卒中病人，男130例，女74例，年齡63～89歲，平均(73.59±14.13)歲，發(fā)病至入院時(shí)間≤7 d；符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中對(duì)腦卒中的診斷。PSE定義為腦卒中7 d后有2次自發(fā)性癲癇發(fā)作或1次癲癇發(fā)作加上腦電圖顯示的癲癇樣放電或經(jīng)頭顱多模式核磁共振(mMRI)顯示的持久相關(guān)病變[6]。癲癇持續(xù)狀態(tài)定義為單次癲癇發(fā)作持續(xù)超過(guò)5 min或者在5 min內(nèi)連續(xù)發(fā)生≥2次發(fā)作且不能恢復(fù)正常意識(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：60～90歲，有明確的缺血性腦卒中病史；符合PSE的診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有顱腦外傷史、熱性驚厥痙攣或癲癇史；(2)合并進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、經(jīng)影像學(xué)證實(shí)存在顱內(nèi)占位性病變、精神病史；(3)合并自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)或其他惡性腫瘤疾??；(4)合并心、肝、腎、血液等系統(tǒng)嚴(yán)重功能障礙。所有病人及家屬均對(duì)本研究知情且簽署知情同意書(shū)，本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)及機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審批備案，所有研究人員均遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 基線數(shù)據(jù)和樣本采集 收集研究對(duì)象的一般資料，包括腦卒中病史、血管疾病的危險(xiǎn)因素(如高血壓、糖尿病、心室顫動(dòng)、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈疾病、吸煙和腦卒中史)、病因、腦電圖、影像學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，包括估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)、Hb、血清肌酐(sCr)、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C以及血清炎癥因子IL-6、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)水平。在病人入院時(shí)和確診PSE時(shí)采集外周靜脈血，分離并提純血清外泌體后，保存在-80 ℃。收集病人的NIHSS評(píng)分，病灶部位及病灶數(shù)。

1.3 隨訪 對(duì)所有病人出院后進(jìn)行為期2年的隨訪觀察，在出院時(shí)以及隨訪結(jié)束時(shí)由同一組接受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的研究人員采用MMSE評(píng)價(jià)認(rèn)知功能，計(jì)算MMSE差值(MMSE差值=隨訪2年后MMSE評(píng)分-出院時(shí)MMSE評(píng)分)，當(dāng)差值為負(fù)數(shù)時(shí)認(rèn)為病人出現(xiàn)了認(rèn)知損害。

1.4 研究方法

1.4.1 血清外泌體的獲取及鑒定：所有病人入組當(dāng)天采集外周靜脈血15 mL置于離心管中，室溫下靜置30 min，待血液凝固后使用離心機(jī)3000 r/min離心10 min，獲取上清液并置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。使用外泌體分離試劑盒(Invitrogen Life Technologies公司，美國(guó))按說(shuō)明書(shū)方法以10 000 r/min超速離心30 min，去除細(xì)胞及碎片后，將外泌體分離試劑與收集的上清液充分混合，并在4℃環(huán)境下孵育30 min。之后，在室溫下以100 000 r/min二次離心5 min，收集管底沉淀外泌體，再次120 000 r/min離心30 s除去沉淀中多余液體，然后用磷酸鹽緩沖液重懸。用透射電鏡觀察顆粒結(jié)構(gòu)和分布。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體標(biāo)記物CD9、CD63、CD81、CD31、Rab5b表達(dá)。

1.4.2 Western blot法檢測(cè)外泌體TSP-1蛋白表達(dá)：采用RIPA蛋白質(zhì)提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó))提取外泌體中的蛋白質(zhì)，使用增強(qiáng)型蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Thermo Scientific公司，美國(guó))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后半干法將目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將該膜與TSP-1(1：2000)、GAPDH(1：5000)一抗分別孵育過(guò)夜，與二抗孵育60 min。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法及Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4.3 ELISA檢測(cè)血清外泌體TSP-1蛋白水平：將提取的血清外泌體總蛋白，進(jìn)一步使用MK3酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司，美國(guó))和TSP-1 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)板上每孔加入100μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育10 min，加入100μL濃縮生物素化Ab，37℃孵育60 min，洗滌3次。然后將100μL抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物加入至每個(gè)孔中，37 ℃反應(yīng)30 min。加入四甲基聯(lián)苯胺37 ℃避光孵育15 min，終止反應(yīng)后，讀取450 nm處的光密度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體提取和鑒定 經(jīng)透射電鏡觀察，可見(jiàn)圓形或橢圓形、茶托狀、雙膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為30～150 nm，粒子濃度約為(4.44±0.34)×108/mL。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，在分離的外泌體顆粒樣本中出現(xiàn)外泌體CD9、CD63、CD81、CD31、Rab5b膜表面標(biāo)記分子表達(dá)，說(shuō)明獲取的血清外泌體可用于蛋白檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

2.2 2組病人一般臨床資料比較 2組病人在飲酒史、發(fā)熱、低鈣血癥、NIHSS評(píng)分、病灶累及皮質(zhì)及eGFR、 IL-6、TGF-β1、TNF-α水平方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

注：A：透射電鏡下觀察外泌體顆粒形態(tài)和大小(×12000)； B：納米粒徑追蹤分析外泌體粒徑分布；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體特征蛋白表達(dá)圖1 血清外泌體鑒定

表1 2組病人一般臨床資料比較(n，%)

2.3 2組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平比較 PSE組血清外泌體蛋白TSP-1的表達(dá)水平經(jīng)Western blot法及ELISA法檢測(cè)均顯著高于非PSE組病人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平比較

2.4 PSE的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析顯示，發(fā)熱、低鈣血癥、NIHSS評(píng)分、血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平均是老年腦卒中病人發(fā)生PSE的獨(dú)立影響因子(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析老年腦卒中病人發(fā)生PSE的影響因素

2.5 血清外泌體蛋白TSP-1預(yù)測(cè)PSE的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，TSP-1對(duì)老年腦卒中病人發(fā)生PSE的預(yù)測(cè)效能AUC為0.886(95%CI：0.829～0.943)，閾值為146.565 pg/mL，在該閾值下，特異度和靈敏度分別為81.8%和87.0%，約登指數(shù)為0.688。見(jiàn)圖2。

圖2 血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平對(duì)老年腦卒中病人發(fā)生PSE預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

2.6 PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平與炎癥因子和認(rèn)知損害的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)與IL-6、TGF-β1、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.699，0.919，0.680，P<0.001)。Spearman相關(guān)性分析顯示，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)與MMSE差值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.768，P<0.001)。

3 討論

老年P(guān)SE的發(fā)病率差異很大，早期癲癇發(fā)病率更高[8]，其中出血轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是早期癲癇發(fā)作最重要的預(yù)測(cè)因素之一。TSP-1作為一種參與血管生成和炎癥反應(yīng)重要的脫細(xì)胞蛋白，在其中的促進(jìn)作用也不可忽視。本研究結(jié)果顯示， PSE組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)顯著高于非PSE組病人，表明TSP-1可能參與了PSE的發(fā)病機(jī)制，此外血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)升高亦是老年腦卒中病人發(fā)生PSE的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

本研究中，204例老年卒中病人發(fā)生PSE 23例(11.27%)。既往研究顯示，缺血性腦卒中發(fā)生PSE的原因是神經(jīng)元的高代謝及高需氧量的特點(diǎn)，使其對(duì)缺氧高度敏感，在發(fā)生缺血性腦卒中急性期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)因缺血、缺氧釋放大量谷氨酸，引起神經(jīng)細(xì)胞膜興奮、γ-氨基丁酸抑制性功能受損，進(jìn)而降低了癲癇的閾值[9-11]。缺血、缺氧引起的腦組織損傷會(huì)導(dǎo)致葡萄糖代謝異常，同時(shí)因鈉、鉀泵功能受損，使細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣離子增加，電解質(zhì)及酸堿平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫、急性代謝功能障礙，同樣影響神經(jīng)元正常放電，引起癲癇發(fā)作。眾多研究表明，癲癇與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，腦損傷可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子，誘導(dǎo)血腦屏障損傷引發(fā)癲癇，而在癲癇發(fā)作后，炎癥反應(yīng)會(huì)加重，此時(shí)的神經(jīng)組織微環(huán)境常伴隨著嚴(yán)重且持續(xù)的炎癥反應(yīng)，形成癲癇發(fā)展的惡性循環(huán)[12]。本研究結(jié)果顯示，PSE組病人的IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均顯著高于非PSE組。

TSP-1是一種黏附糖蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于活化的血小板中，能介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用，在細(xì)胞表面表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[13]。有研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)輕度腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TSP-1是短暫性腦缺血發(fā)作狀態(tài)的潛在重要預(yù)測(cè)因素[14]。因此，本研究探究了血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)水平與老年腦卒中病人發(fā)生PSE的相關(guān)性，結(jié)果顯示TSP-1是老年腦卒中病人發(fā)生PSE的獨(dú)立影響因素，可預(yù)測(cè)老年腦卒中病人發(fā)生PSE。血漿中TSP-1水平在患有心血管疾病和炎癥性疾病以及通常伴有心血管并發(fā)癥的疾病病人中顯著升高，尤其是在缺血性血管疾病中更明顯，老年缺血性腦卒中病人的血漿TSP-1水平明顯高于正常對(duì)照組病人[15]，其重要的機(jī)制在于TSP-1通過(guò)激活TGF-β途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)；此外TSP-1可通過(guò)參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞表面受體及NF-κB的活性來(lái)影響炎癥反應(yīng)，如TSP-1可通過(guò)對(duì)IL-1β通路發(fā)揮CD47依賴(lài)和不依賴(lài)的促炎和抗炎作用[16]，從而加重機(jī)體微炎癥狀態(tài)。在本研究中，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)與IL-6、TGF-β1、TNF-α呈正相關(guān)。此外Cheng等[17]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除TSP-1基因小鼠在顱腦外傷后血腦屏障損傷較野生型加重，且表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知功能方面的嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損，Kim等[18]也證實(shí)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的TSP-1可以恢復(fù)AD環(huán)境中的α2δ-1和Neuroligin-1受體的表達(dá)水平，減輕淀粉樣蛋白β肽誘導(dǎo)的突觸功能障礙，這與認(rèn)知和記憶障礙密切相關(guān)，同時(shí)還與癲癇相關(guān)。因此我們進(jìn)一步分析了血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)與PSE病人認(rèn)知功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達(dá)與MMSE差值呈負(fù)相關(guān)，PSE病人的血清外泌體蛋白TSP-1水平越高，越易出現(xiàn)認(rèn)知損害。

綜上所述，對(duì)于老年缺血性腦卒中病人，血清外泌體蛋白TSP-1高表達(dá)者更易發(fā)生PSE，這可能與TSP-1激活TSP-1/TGF-β1途徑和誘導(dǎo)血清炎癥因子水平升高有關(guān)。此外，血清外泌體蛋白TSP-1高表達(dá)還可能加重PSE病人的認(rèn)知損害。檢測(cè)血清外泌體蛋白TSP-1對(duì)預(yù)測(cè)老年腦卒中病人PSE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有一定參考價(jià)值。而且血清外泌體蛋白TSP-1也有望成為預(yù)測(cè)老年腦卒中病人發(fā)生PSE的重要靶標(biāo)。