吳思佳，謝星光，楊 陽(yáng)，鄭承劍，韓 婷 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200433）

植物內(nèi)生真菌與宿主植物共生，可調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)多種生物和非生物脅迫，促進(jìn)植物產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物[1-4]。除了對(duì)自身宿主植物的有益影響，當(dāng)前已有許多研究表明內(nèi)生真菌對(duì)非宿主植物同樣具有重要的生態(tài)功能，如分離自短芒大麥草、麥草、醉馬草的內(nèi)生真菌asexualEpichlo?gansuensis可顯著改善老芒麥種子萌發(fā)并促進(jìn)其生長(zhǎng)[5]；分離自沙漠植物的印度梨形孢（Piriformaspore indica）可促進(jìn)藥用植物丁香羅勒生長(zhǎng)并減少葉和莖中熊果酸和齊墩果酸的積累[6]；分離自重陽(yáng)木的內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis sp.）可加快藥用植物蒼術(shù)凋落物木質(zhì)素的降解，有助于減小連作障礙效應(yīng)[7]。這些現(xiàn)象為內(nèi)生菌資源的新生態(tài)功能研究，及其對(duì)非宿主藥用植物的活性成分的研究提供了新的思路，促使越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在這一領(lǐng)域開展相關(guān)研究。

中藥丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza的干燥根和根莖[8]，是一種被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病治療的重要中藥材[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參的主要活性成分為脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的丹參酚酸類化合物[10]。本課題組前期獲得一種可促進(jìn)模式植物擬南芥生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌Epichlo? bromicolaSH09。E. bromicola是一種與冷季型牧草長(zhǎng)期、永久共存的內(nèi)生真菌，可導(dǎo)致禾草香柱病[11-13]，其對(duì)雙子葉藥用植物的生長(zhǎng)和代謝是否有影響尚不明確。因此，本文主要探究?jī)?nèi)生真菌E. bromicolaSH09 是否可以促進(jìn)模式藥用植物丹參生長(zhǎng)，增加其活性成分的積累，研究成果有助于理解內(nèi)生真菌對(duì)非宿主植物產(chǎn)生的生態(tài)功能，并有助于丹參生物菌肥的栽培應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌肥

內(nèi)生真菌E. bromicolaSH09 由本課題組保存。使用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）活化E.bromicolaSH09 菌株，溫度為（28± 1）℃。4 周后，在PDA 平板上使用打孔器打孔，將E. bromicolaSH09 菌塊轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，條件為25 ℃，140 r/min。本研究所用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基由250 g 麥麩，250 g 棉籽殼，20 g葡萄糖，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4.7H2O，加1 L 去離子水組成，經(jīng)121 ℃，30 min 高壓滅菌后備用。接著將培養(yǎng)7 d 的E. bromicolaSH09 培養(yǎng)液倒入含40 g 固體培養(yǎng)基中（容器為250 ml 培養(yǎng)瓶，圖1 C），用接種針混勻后劃成1 cm×1 cm 方塊，25℃條件下培養(yǎng)3 周，得到表面長(zhǎng)滿菌絲的E. bromicolaSH09 固體菌肥（圖1A 菌株正面，圖1B 菌株背面）。

圖1 E. bromicola SH09 菌株和固體發(fā)酵菌肥

1.1.2 供試丹參

丹參種子來(lái)源于陜西省商洛市天士力丹參種植基地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院院長(zhǎng)秦路平教授鑒定。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹酚酸B 均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，甲醇、乙腈為色譜純。

1.2 E. bromicola 固體菌肥與丹參共培養(yǎng)

將丹參種子播種至潤(rùn)濕的混合栽培基質(zhì)（腐殖土：蛭石=1：1）中，于22～ 24 ℃，16/8 h 光照周期條件培養(yǎng)1 個(gè)月。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的丹參苗，繼續(xù)培養(yǎng)20 d。選取15 株5 cm 左右高的丹參苗，隨機(jī)分成3 組，分別為對(duì)照組、菌肥處理60 d 組、菌肥處理120 d 組，每組5 株，菌肥處理組于根部均勻撒20 gE. bromicolaSH09 固體菌肥，對(duì)照組于根部均勻撒20 g 不含菌的固體菌種培養(yǎng)基。隔天澆水。

共培養(yǎng)至第60 天和第120 天分別收獲丹參苗，測(cè)定植株的分蘗數(shù)、株高（以分蘗的長(zhǎng)度作為株高）、葉數(shù)、葉面積作為形態(tài)指標(biāo)；沖洗丹參根，拭去表面的水，稱量鮮重；將新鮮的丹參根置于50 ℃烘箱干燥1 周，稱量干重；研磨干燥的丹參根，過(guò)40 目篩，用于測(cè)定丹參酮和丹參酚酸含量。

1.3 丹參酮和丹參酚酸的HPLC 分析方法

精密稱取0.20 g 丹參根粉末，加入4 ml 甲醇浸泡過(guò)夜，500 W 超聲提取45 min，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。利用Agilent -1 200 自動(dòng)進(jìn)樣色譜儀，Agilent ZORBAX SB - C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行丹參酮和丹參酚酸的含量測(cè)定。色譜條件：流速為0.8 ml /min ；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%甲酸水(B)；梯度洗脫：0～20 min，20 %～40 %A；20～21 min，40%～80% A；21～40 min，80%～90% A；40～45 min，90%～20% A。分別進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)，以驗(yàn)證分析方法的可行性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 E. bromicola 對(duì)丹參生長(zhǎng)的影響

通過(guò)丹參苗的4 個(gè)形態(tài)指標(biāo)和丹參根的鮮重、干重2 個(gè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)內(nèi)生真菌E. bromicolaSH09對(duì)丹參生長(zhǎng)的影響。由圖2 可知，E. bromicolaSH09與丹參共培養(yǎng)60 d 和120 d 后，共培養(yǎng)組丹參苗的分蘗數(shù)（圖2C）、株高（圖2D）、葉片數(shù)（圖2E）、葉面積（圖2F）與對(duì)照組相比均顯著增加。其中分蘗數(shù)在共培養(yǎng)60 d 和120 d 后分別是對(duì)照組的1.48和2.29 倍；株高分別是對(duì)照組的1.33 倍和1.48 倍；葉片數(shù)分別是對(duì)照組的1.33 倍和2.37 倍；葉面積分別是對(duì)照組的2.00 倍和2.32 倍。

圖2 E. bromicola 對(duì)丹參苗生長(zhǎng)的影響

由圖3 可得，E. bromicolaSH09 與丹參共培養(yǎng)60 d 和120 d 后，丹參根的生物量與對(duì)照組相比顯著提高。其中，丹參根的鮮重在共培養(yǎng)60 d 和120 d后分別是對(duì)照組的2.11 和2.16 倍（圖3A）；干重分別是對(duì)照組的3.06 倍和2.73 倍（圖3B）。上述結(jié)果均表明內(nèi)生真菌E. bromicolaSH09 可促進(jìn)丹參苗的生長(zhǎng)。

圖3 E. bromicola 對(duì)丹參苗生物量的影響

2.2 E. bromicola 對(duì)丹參活性成分積累的影響

測(cè)定丹參干燥根中4 種丹參酮類成分和2 種丹參酚酸類成分的含量，以探究E. bromicolaSH09對(duì)丹參活性成分積累的作用。由圖4、圖5 可知，E. bromicolaSH09 與丹參苗共培養(yǎng)60 d 和120 d可顯著促進(jìn)丹參根中4 種丹參酮類成分和2 種丹參酚酸類成分的積累。對(duì)于丹參酮類成分，在共培養(yǎng)60 d 和120 d 后，共培養(yǎng)組隱丹參酮含量分別是對(duì)照組的5.77 倍和2.63 倍（圖4A）；二氫丹參酮I含量在共培養(yǎng)60 d 后是對(duì)照組的2.57 倍，在共培養(yǎng)120 d 后無(wú)顯著差異（圖4B）；丹參酮I 含量分別是對(duì)照組的2.49 倍和2.29 倍（圖4C）；丹參酮IIA含量分別是對(duì)照組的3.44 倍和2.13 倍（圖4D）。對(duì)于丹參酚酸類成分，在共培養(yǎng)60 d 和120 d 后，共培養(yǎng)組丹酚酸B 含量分別是對(duì)照組的 1.76 倍和1.32 倍（圖5A）；迷迭香酸含量在共培養(yǎng)60 d 后是對(duì)照組的1.32 倍，而共培養(yǎng)120 d 后與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖5B）。綜上可得，E. bromicolaSH09 可促進(jìn)丹參根中丹參酮類和丹參酚酸類成分的積累。

圖4 E. bromicola 對(duì)丹參根中丹參酮類成分的影響

圖5 E. bromicola 對(duì)丹參根中丹參酚酸類成分的影響

3 討論

由于丹參對(duì)心腦血管疾病有顯著療效，丹參相關(guān)制劑在全球范圍有較高需求量。然而現(xiàn)產(chǎn)丹參多為栽培種，不同產(chǎn)區(qū)品質(zhì)參差不齊，且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)2 年，因此我們亟需對(duì)其傳統(tǒng)培育技術(shù)進(jìn)行改良，以得到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)丹參[14-15]。植物內(nèi)生真菌普遍存在于植物健康組織中[4]，已有研究表明，內(nèi)生真菌可以通過(guò)促進(jìn)藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物積累，從而提高藥用植物品質(zhì)[16-18]。本研究探究了內(nèi)生真菌E. bromicolaSH09 對(duì)丹參生長(zhǎng)及其活性成分丹參酮和丹參酚酸積累的影響。

研究結(jié)果顯示，E. bromicolaSH09 與丹參苗共生2 個(gè)月和4 個(gè)月后，分蘗數(shù)、株高、葉片數(shù)、葉面積以及鮮重、干重均較對(duì)照組顯著提高，且分蘗數(shù)、株高、葉片數(shù)、葉面積、鮮重的促進(jìn)程度（與對(duì)照組相比）均隨著培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)而增加。已有研究表明內(nèi)生真菌深綠木霉D16 菌肥可有效促進(jìn)藥用植物丹參的生長(zhǎng)及其活性成分丹參酮的積累[3]，5、15、25 g D16 菌肥分別培養(yǎng)丹參4 個(gè)月后，3 種濃度的菌肥對(duì)丹參干重的促進(jìn)程度均不及本研究E. bromicolaSH09 對(duì)丹參干重的促進(jìn)程度。但D16 菌肥培養(yǎng)丹參6～8 個(gè)月時(shí)，丹參苗快速生長(zhǎng)，15 g D16 培養(yǎng)丹參8 個(gè)月后，其干重高達(dá)對(duì)照組的5.61 倍。E. bromicolaSH09 與丹參苗共生2 個(gè)月和4 個(gè)月后，丹參酮（隱丹參酮、二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA）和丹參酚酸（丹酚酸B、迷迭香酸）含量均被顯著增加，其中隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA 和丹酚酸B 的積累被持續(xù)促進(jìn)。D16與丹參共培養(yǎng)后和E. bromicolaSH09 有類似作用，且該作用在共培養(yǎng)6 個(gè)月后達(dá)到峰值。丹參是多年生植物，故E. bromicolaSH09 在4 個(gè)月后如何影響丹參的生長(zhǎng)和活性成分積累有待進(jìn)一步研究。目前，內(nèi)生真菌對(duì)非宿主藥用植物的作用研究仍不夠深入。內(nèi)生真菌可能通過(guò)促光合作用促進(jìn)藥用植物生長(zhǎng)，通過(guò)介導(dǎo)植物體內(nèi)信號(hào)分子、酶基因、植物激素等調(diào)節(jié)藥用植物次生代謝，從而提高藥用植物的品質(zhì)。有研究表明，毛竹的3 種內(nèi)生菌均可提高葉綠素含量，促進(jìn)光合作用，以促進(jìn)毛竹生長(zhǎng)[19]；地黃內(nèi)生真菌GG22 通過(guò)誘導(dǎo)茉莉酸合成關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)地黃中茉莉酸類物質(zhì)[20]；丹參內(nèi)生真菌U104 通過(guò)上調(diào)丹參酮生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因促進(jìn)丹參酮的積累[21]；轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)共同揭示了丹參內(nèi)生真菌制備的誘導(dǎo)子通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子、氧化應(yīng)激、乙烯、茉莉酸、水楊酸等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程影響丹參酮和丹參酚酸的代謝[22]；并有研究推測(cè)藥用植物龍膽的3 種木霉屬內(nèi)生菌通過(guò)改變龍膽中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物的酶活性提高植物抗病性[23]。然而，E. bromicolaSH09 具體通過(guò)怎樣的途徑促進(jìn)丹參生長(zhǎng)和活性成分積累，也有待更深層的研究。