崔曉林，桂 玲，朱 茜，陸 峰 （. 中國人民解放軍63680 部隊醫(yī)院, 江蘇 江陰 4400；. 海軍軍醫(yī)大學藥學系藥物分析教研室, 上海 00433）

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)作為一種高效、快速、靈敏的分析手段，受到各個領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[1-2]。SERS 技術(shù)在原有拉曼光譜的基礎(chǔ)上將被測物質(zhì)的信號提高了106～1014倍[3]，并且，通過SERS 技術(shù)可以獲取被測物質(zhì)詳細的指紋圖譜，是鑒別、檢測結(jié)構(gòu)類似物最有效的分析手段之一[4-5]。但是，利用單一的SERS 技術(shù)對混合體系中的目標物進行檢測是十分困難的。而通過聯(lián)用其他分析手段可有效的彌補單一SERS 技術(shù)檢測的不足，提高SERS 技術(shù)的檢測能力和表征能力。本文將可以與SERS 聯(lián)用的技術(shù)方法進行系統(tǒng)地分類，并對聯(lián)用的機理和優(yōu)勢進行闡述。

1 表面增強拉曼光譜簡介

拉曼散射由印度著名物理學家C.V Raman 首次發(fā)現(xiàn)，他通過實驗證明，當一束光通過介質(zhì)時，光子與物質(zhì)分子可以發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞兩種形式。彈性碰撞只改變光子的運動方向，不損耗光子的能量，稱之為瑞利散射；而非彈性碰撞在改變光子的運動方向的同時也會損耗光子自身能量，即散射光的頻率發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱之為拉曼散射，由此形成了以拉曼散射為基礎(chǔ)的拉曼光譜技術(shù)。表面增強拉曼光譜是在拉曼光譜技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型分析手段，主要利用粗糙金屬（金、銀、銅）表面吸附被測物質(zhì)，使得被測物質(zhì)信號急劇增強，極大地提高了檢測的靈敏度[6-7]。目前，普遍公認的兩種增強機理是：化學增強和電磁增強[2,8]?；瘜W增強主要認為待測物質(zhì)分子與粗糙金屬表面發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移的相互作用，但該作用對于物質(zhì)信號增強作用較小。電磁增強主要認為入射光照射到粗糙金屬表面，當光子頻率與電子振動頻率一致時，共振發(fā)生，金屬表面磁場極大增強。因此，置于此磁場中的物質(zhì)分子的拉曼信號也得到了大幅增強，甚至對單分子測定仍然具有較高的靈敏度和準確性[9]。SERS 技術(shù)因其獨特的指紋圖譜特性，成功且廣泛地應用在藥品和食品分析[10-11]、農(nóng)藥殘留檢測[12]、環(huán)境監(jiān)控[13]、生物樣品測定[14-15]、細菌[16]以及細胞檢測[17]等領(lǐng)域。

盡管SERS 技術(shù)具有靈敏度高、檢測速度快、樣品需求量少等優(yōu)點，但仍然有一些在實際應用中無法克服的缺點。例如，SERS 不是一個分離手段，而真實樣品往往不是單一組分，是多種物質(zhì)的混合體系。因此，單獨使用SERS 技術(shù)對混合體系中的目標物質(zhì)進行準確鑒別是一個巨大的挑戰(zhàn)。同樣，單純依靠SERS 技術(shù)獲得的指紋圖譜無法實現(xiàn)對未知物質(zhì)精確表征。因此，SERS 聯(lián)合其他技術(shù)手段來對被測物質(zhì)進行準確測定成為必然趨勢。通過聯(lián)用的方式，提高SERS 在檢測和表征方面的不足，實現(xiàn)對被測物質(zhì)高效、靈敏、準確測定的目的。許多技術(shù)方法都可以與SERS 技術(shù)聯(lián)用，并且成功的應用在實際檢測中[18-19]。其中聯(lián)用后可以提高SERS 檢測能力的方法主要有：① 分離技術(shù)：包括萃取法、薄層色譜法、高效液相色譜法；② 捕捉技術(shù)：包括抗體、適配體，分子印跡法；③ 微流體技術(shù)。聯(lián)用后可以提高SERS 表征能力的方法主要有：質(zhì)譜、核磁共振光譜、紅外光譜以及原子力顯微鏡等。

2 SERS 與用以提高檢測能力的技術(shù)聯(lián)用

2.1 與分離技術(shù)聯(lián)用

在對樣品進行SERS 檢測之前，首先利用分離技術(shù)處理被測體系，利用目標物質(zhì)與復雜體系中其它雜質(zhì)的理化性質(zhì)的不同，分離提純目標物，同時富集目標物含量，可以顯著提高SERS 檢測的準確性和靈敏度。常見的分離技術(shù)主要有：萃取法、薄層色譜法、高效液相色譜法等。

2.1.1 與萃取法聯(lián)用

萃取法主要是利用復雜體系中各組分在不同相中的溶解度差異，從而將目標物從一相轉(zhuǎn)移到另一相的過程。萃取方式主要包括固-液、液-液、氣-液的萃取等。萃取法操作簡單、成本低、快捷，是傳統(tǒng)的樣品前處理方法之一[20]。將萃取法應用在SERS 檢測之前，利用萃取技術(shù)對復雜樣品中的目標物進行提純，同時，還可以富集被測目標物含量，將復雜體系單純化，然后與增強試劑按照比例進行預處理，最后利用SERS 技術(shù)進行分析測定，即可得到分析物詳細的指紋圖譜。如今。微萃取的發(fā)展，克服了傳統(tǒng)萃取法樣品需求量大的缺點，使得萃取-SERS 聯(lián)用可以更好地應用到食品、藥品等各個領(lǐng)域[21]。但是萃取法同時也存在一些缺點，即無法分離混合體系中對于同一萃取相溶解度相近的物質(zhì)。

2.1.2 與薄層色譜法聯(lián)用

薄層色譜法（TLC）隸屬于平面色譜法，是指將固定相涂于玻璃板、鋁箔等平面上，形成一層均勻的薄層后，將試樣點在薄層板底端，然后放置到盛有適宜展開劑的玻璃容器內(nèi)展開，從而實現(xiàn)將目標物與其它物質(zhì)分離的目的。同時，利用各組分在薄層板上的比移值的不同，達到分離鑒別的目的。該方法具有分析速度快、操作簡單、成本低、效率高、分析結(jié)果直觀等優(yōu)點[22-23]。TLC 與SERS 主要有兩種聯(lián)用模式。一種是將固定相和增強試劑同時涂于TLC 板上，待試樣經(jīng)過TLC 分離后，可直接利用SERS 檢測[24]。或者，TLC 板僅由固定相組成，待樣品經(jīng)過展開劑分離后，將增強試劑均勻地噴涂于整個薄層板上，或噴涂在展開之后的樣品點上，然后再采集該點SERS 圖譜，這樣便可以獲取具有高強度檢測信號的被測物質(zhì)詳細的指紋圖譜信息[25]。TLC-SERS 聯(lián)用可排除其他無關(guān)雜質(zhì)的干擾，極大地提高SERS 檢測的靈敏度和準確性。自1977 年提出至今，TLC-SERS 聯(lián)用方法因其操作簡單、快速、高效等優(yōu)勢，廣泛地應用在食品、藥品、合成染料、生物樣品分析等領(lǐng)域[26-28]。

2.1.3 與高效液相色譜法聯(lián)用

盡管利用TLC 可以快速分離復雜體系中不同組分的物質(zhì)，但是相比于高效液相色譜法（HPLC），TLC 的分離效能和穩(wěn)定性相對較弱，無法分離體系中與目標物結(jié)構(gòu)、極性十分相近的化合物。而HPLC是最常見的柱色譜之一，具有高效的固定相，同時采用高壓輸送流動相的方式，使得HPLC 具有分離效能好、分析時間短、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點[29-30]。但是在具有高密度峰的色譜中，單個峰的歸屬變得困難，僅僅依靠保留時間對復雜體系進行定性分析，往往得不到預期結(jié)果。所以，將具有良好分離效能的HPLC 與SERS 聯(lián)用，就可以得到被測組分詳細的結(jié)構(gòu)信息。常見的聯(lián)用方式，主要是被測組分流經(jīng)色譜柱和檢測器后與惰性金屬溶膠溶液進行預處理后，再混合流入SERS 測試流動池。此時，既可以對分離液進行不間斷收集，采集各個時間段SERS 圖譜；也可以利用檢測器分析結(jié)果，收集相對應的色譜峰的流出液，獲取目標物的SERS 峰，實現(xiàn)HPLC-SERS 的離線檢測。隨著SERS 檢測系統(tǒng)的不斷發(fā)展，HPLC-SERS 聯(lián)用可以直接利用SERS 儀器代替HPLC 中的檢測器進行分析，真正實現(xiàn)“即流即測”動態(tài)檢測的在線分析測定[31]。經(jīng)過HPLC 分離得到的試樣組分純度高，雜質(zhì)少，為之后SERS 檢測到單一的、含量高純物質(zhì)信號提供保障。如今，HPLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)成功的應用在痕量分析等各個領(lǐng)域中[24,32]。

2.2 SERS 與捕捉技術(shù)聯(lián)用

SERS 技術(shù)幾乎不具有選擇性，當混合體系中存在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)十分相近，通過上述分離技術(shù)得不到良好區(qū)分時，就無法通過SERS 采集到精準的目標物質(zhì)圖譜。所以，需要借助一些捕捉技術(shù)特異性地識別目標物質(zhì)，從而將目標物質(zhì)從被測體系中分離出來。因此，通過聯(lián)用捕捉技術(shù)與SERS，實現(xiàn)對目標物質(zhì)的選擇性檢測，縮短分析測定的時間。

2.2.1 與抗體捕捉技術(shù)聯(lián)用

抗體是一類可以特異性識別抗原，并與抗原以高親和力、高選擇性結(jié)合的蛋白質(zhì)，是臨床免疫分析的常用物質(zhì)。通過抗體捕捉技術(shù)，可以檢測特定分子如：蛋白質(zhì)、細胞、細菌等生物分子的濃度，或者驗證它們的存在[33-35]。經(jīng)由特異性識別、捕捉的過程，可以將目標物從生物復雜體系中分離出來，同時排除待測體系中其他雜質(zhì)的干擾。這樣一種高選擇性、高靈敏度的聯(lián)用方式逐漸引起了人們廣泛的關(guān)注。其中最常見的抗體捕捉技術(shù)與SERS的聯(lián)用方式是：首先將抗體固定在磁珠上，這樣固定好的抗體就會與混合體系中的抗原（目標物分子）特異性結(jié)合，然后標簽分子（由惰性金屬納米顆粒和抗體組成，必要時也可加入信號分子）與上述被捕捉的抗原分子結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，然后利用磁珠將該結(jié)構(gòu)從混合液中分離，這樣便得到了單一的被測目標物。此時將該目標物與惰性金屬溶膠液預處理后，即可利用SERS 技術(shù)進行檢測，得到抗原分子準確詳細的指紋圖譜[36-38]。該方法極大地排除了無關(guān)雜質(zhì)的干擾，提高了分析方法的選擇性，同時降低了被測物質(zhì)的檢測限。

2.2.2 與適配體捕捉技術(shù)聯(lián)用

適配體通常是指具有特定空間結(jié)構(gòu)的單鏈核酸序列，相比于抗體分子，適配體具有更好的熱穩(wěn)定性、鹽耐受性，并且易合成儲存、價格低廉等優(yōu)點[39-40]。近年來，適配體被廣泛地應用到藥物、蛋白質(zhì)、細胞、細菌等分子的分析檢測領(lǐng)域中，是臨床治療診斷的常用手段。利用適配體對配體分子的高親和力和高選擇性，可以將配體分子從混合體系中識別并分離出來，分離得到的純物質(zhì)再與惰性金屬溶膠液預混，然后進行SERS 檢測。檢測結(jié)果通常分為以下3 種情況：①大多數(shù)情況下，如適配體分子本身不產(chǎn)生拉曼信號，適配體捕捉到配體分子形成復合物后，通過SERS 采集到的圖譜均為配體分子的拉曼信號；②如適配體與配體分子均產(chǎn)生較強的拉曼信號，二者結(jié)合形成復合物后，通過SERS 采集到的信號為二者之和，此時需要扣除適配體的背景信號以獲取配體分子信息；③如配體分子并無拉曼特征峰，而適配體分子拉曼信號強烈，則可以通過配體與適配體結(jié)合后，適配體構(gòu)象改變所引起的拉曼信號的改變來判斷配體分子的存在（見圖1）。通過捕捉適配體的方式與SERS 檢測聯(lián)用，解決了SERS 選擇性差的問題，極大地提高了SERS 檢測的靈敏度和準確度，有助于獲得目標物質(zhì)準確的結(jié)構(gòu)特征信息。該聯(lián)用方法正廣泛的應用在檢測、傳感、臨床診斷和治療等各個領(lǐng)域。

圖1 SERS 與適配體捕捉技術(shù)聯(lián)用的方式

2.2.3 與分子印跡技術(shù)聯(lián)用

抗體和適配體在生物大分子的選擇、識別方面具有突出優(yōu)勢，而在低分子量的小分子檢測中，分子印跡技術(shù)優(yōu)勢顯著。分子印跡技術(shù)是人工合成與目標分子特異性結(jié)合的功能單體，利用適當?shù)慕宦?lián)劑使功能單體聚合，形成共聚物，然后再將目標分子脫去，這樣聚合物中就形成能與目標分子高度互補的空間結(jié)構(gòu)，類似于“鎖-鑰”結(jié)構(gòu)，利用這種結(jié)構(gòu)的互補性，可以重新與目標分子特異性結(jié)合，能夠在復雜體系中準確、專一地識別和分離目標分子[41-43]。此時，將分離得到的目標物與惰性金屬溶膠進行預處理，便可直接利用SERS 技術(shù)采集詳細的指紋圖譜，獲取目標物的化學結(jié)構(gòu)特征。通過分子印跡技術(shù)合成的功能單體聚合物又稱為分子印跡聚合物，該聚合物能夠重復利用，穩(wěn)定性好，排除體系中其他物質(zhì)的干擾，與SERS 技術(shù)聯(lián)用后，可有效的提高SERS 檢測的選擇性，并且可以對被測物質(zhì)含量進行富集，極大地降低了SERS 的檢測限，是痕量物質(zhì)檢測首選的分析方法，已成功地應用在食品、藥品摻雜分析等領(lǐng)域[44-46]。

2.3 與微流體技術(shù)聯(lián)用

微流體技術(shù)的發(fā)展使在微觀尺寸下，對微量液體精確操控和處理成為可能[47-48]。在微流體通道里，被測樣品溶液以恒定的速度均勻流動，解決了由于人工上樣導致SERS 檢測結(jié)果不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差的問題，實現(xiàn)對被測樣品實時監(jiān)控的目的。微流體與SERS 的聯(lián)用可以通過“Y”型管道實現(xiàn)，被測樣品溶液和惰性金屬銀膠溶液分別從“Y”型管道的兩支流入，并成功在“Y”型管道中混合，經(jīng)過一定時間的充分混合，最終流入SERS 檢測體系，便可以采集目標物SERS 圖譜[49-50]。當然，也可以將惰性金屬納米顆粒直接加入到通道里，這樣當樣品溶液流入后，就可以直接被SERS 檢測。若與多通道的微流體技術(shù)聯(lián)用，則可以實現(xiàn)SERS 的高通量檢測，極大地縮短了檢測時間，使檢測流程程序化、精確化。因此微流體技術(shù)與SERS 的聯(lián)用，使得SERS 檢測更加穩(wěn)定、實時、高效。

3 SERS 與用以提高表征能力的技術(shù)聯(lián)用

通過SERS 圖譜可以獲得分析物詳細的指紋圖譜，但是當沒有標準品作為對照時，僅僅依靠SERS 圖譜信息，對未知化合物進行鑒別、分析是十分困難的，需要借助其他技術(shù)，來彌補SERS 圖譜的不足，對未知分析物進行全面、準確地分析測定。與SERS 聯(lián)用后可以提高SERS 表征能力的常用技術(shù)有：質(zhì)譜、核磁共振光譜、紅外光譜以及原子力顯微鏡。

3.1 與質(zhì)譜聯(lián)用

質(zhì)譜（MS）法主要是依靠多種離子化技術(shù)，將待測分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子形式，并得到一系列碎片離子，這些碎片離子按照質(zhì)荷比（m/z）大小順序排列，最終被記錄形成圖譜。MS 法靈敏度高、分析速度快、信息量大，通過MS 分析可以準確獲取被測物的相對分子質(zhì)量，是物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析強有力的工具。然而。單一的MS 分析無法區(qū)分光學異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體，以及確定取代基的位置等等。而SERS圖譜雖然可以提供有關(guān)被測物詳細的結(jié)構(gòu)信息，但是物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與金屬納米顆粒表面無法產(chǎn)生強烈的共振效應，導致分子結(jié)構(gòu)中的某些信息沒有展現(xiàn)在SERS 圖譜中。Bei 等以Ag 納米溶膠為介質(zhì)，同時應用于SERS 和MS 檢測，得到了羅丹明6G、對氨基苯硫酚和二羥基苯甲酸3 種物質(zhì)精確的結(jié)構(gòu)信息[51]。因此，聯(lián)用SERS-MS 便可以同步獲取目標化合物二維圖像和物質(zhì)組成信息，實現(xiàn)全面而準確地分析的目的[52]。

3.2 與核磁共振光譜聯(lián)用

核磁共振（NMR)光譜是指在外加磁場作用下，原子核內(nèi)部存在著不同能級，當用一定頻率的射頻照射樣品分子時，原子核自旋能級躍遷，產(chǎn)生核磁共振，以共振信號強度和照射頻率作圖，即得核磁共振光譜圖[53]。常用的NMR 光譜主要有氫譜和碳譜，根據(jù)NMR 光譜圖提供的信息，可以預測被測物的分子基團、化學環(huán)境、反應狀態(tài)和原子相對數(shù)量，廣泛用于研究有機分子的性質(zhì)。SERS在獲取物質(zhì)表面信號方面具有極高靈敏度，但是較強的物質(zhì)往往會掩蓋整體信號，使得SERS 獲取的被測物質(zhì)的信號較為片面，而與NMR 聯(lián)合應用便可相互補充，彌補SERS 在分子基團結(jié)構(gòu)預測方面的不足。Cheng 等曾利用SERS 和NMR 技術(shù)，成功對聚集誘導發(fā)光分子的分子內(nèi)轉(zhuǎn)動情況與光致發(fā)光之間的關(guān)聯(lián)進行研究，并取得滿意結(jié)果[54]。因此，NMR-SERS 聯(lián)用可以對被測物質(zhì)進行詳細、準確地預測和鑒別。

3.3 與紅外光譜聯(lián)用

紅外光譜（IR）是指物質(zhì)分子吸收連續(xù)波長的紅外光后，分子振動能級發(fā)生躍遷產(chǎn)生紅外光譜圖。吸收輻射的頻率與化學鍵的振動或原子躍遷的能量相匹配，每一個物質(zhì)都有自身特征的吸收峰，因此，IR 圖譜具有特征性和指紋性。根據(jù)IR 圖譜中吸收峰的位置、強度、形狀可以判斷被測物的基團、化學鍵類型等等。IR 和SERS 圖譜都是分析、檢測物質(zhì)結(jié)構(gòu)強有力的工具，但是由于兩種技術(shù)原理不同，所以對于同一化學鍵或基團的表征能力有所區(qū)別。例如，紅外光譜對水溶液具有強吸光度，會使被測樣品的水溶液產(chǎn)生高強度背景信號，掩蓋目標物的信號。而水溶液是弱的拉曼散射體，SERS 光譜對水溶液幾乎不顯示，是紅外光譜良好的補充技術(shù)，兩者合用的目的主要是信息加和。Howbeer 等利用SERS 和IR 光譜對自然界中的微生物進行鑒別區(qū)分，并得到了各類微生物詳細全面的結(jié)構(gòu)信息[55-56]。因此，將IR 與SERS 聯(lián)用，取長補短，會比單獨使用一種方法預測物質(zhì)結(jié)構(gòu)更加真實可靠。

3.4 與原子力顯微鏡聯(lián)用

原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)是一種可以根據(jù)顯微探針受力情況計算得到被測物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)表面高度，從而獲得樣品形態(tài)的三維信息的成像技術(shù)。AFM 既可以在空氣中工作，也可以在緩沖溶液等近生理條件下工作。具有高分辨率、樣品無損、應用范圍廣、前處理簡單等優(yōu)勢[57]。Ece 等利用AFM 和SERS 技術(shù)對連接在去污劑耐受膜上的鼠諾如病毒進行研究，并對兩者之間的相互作用情況進行分析。從SERS 圖譜解讀病毒分子內(nèi)部成鍵和結(jié)構(gòu)信息，利用AFM 對樣品外部形態(tài)進行表征，如此，便可以對測定的物質(zhì)有全面深入的了解[58]。

4 總結(jié)

SERS 因其靈敏度高、分析速度快、樣品需求量小以及可以提供被測物質(zhì)詳細的指紋圖譜等優(yōu)點在物質(zhì)檢測、分析、結(jié)構(gòu)預測等領(lǐng)域顯示出巨大的應用前景。然而，SERS 對于復雜樣品體系顯示出較弱的檢測能力，以及單純依靠SERS 圖譜無法準確預測分子的結(jié)構(gòu)信息。因此，需要將SERS 技術(shù)與其他技術(shù)手段聯(lián)合應用，以增強SERS 的檢測能力和表征能力，實現(xiàn)對被測分子高選擇性和高靈敏度的檢測。