周 嘉， 李 娜， 戴素明， 鄧子牛， 李大志*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.貴州省果樹(shù)科學(xué)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

0 引言

【研究意義】湖南柑橘栽培歷史悠久，目前種植面積居全國(guó)第二，是國(guó)內(nèi)重要的甜橙產(chǎn)區(qū)之一[1]。冰糖橙(CitrussinesisOsback)又名冰糖柑，是20世紀(jì)70年代選育的優(yōu)良低酸甜橙品種[2]，具有低酸、脆嫩化渣等優(yōu)點(diǎn)，與國(guó)內(nèi)外其他低酸類(lèi)甜橙品種有明顯區(qū)別，是湖南重點(diǎn)推廣的優(yōu)良甜橙品種[3]。冰糖橙經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，已成為湖南特色主栽甜橙品種，在湖南洪江、麻陽(yáng)、永興以及云南新平有大面積推廣種植[4]。開(kāi)展紅肉冰糖橙育種工作可進(jìn)一步豐富冰糖橙產(chǎn)區(qū)品種資源，為冰糖橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更多的品種選擇，對(duì)其產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，全球柑橘育種成果豐碩，通過(guò)芽變選種、資源發(fā)掘和雜交選育等方式已培育出100余個(gè)柑橘品種，特別是鮮食柑橘品種[5-6]。柑橘品種選育多依賴(lài)于芽變選種，尤其是性器官敗育的臍橙和溫州蜜柑品種，紅肉臍橙是從華盛頓臍橙中發(fā)現(xiàn)的果肉紅色芽變[7]，橘湘早[8]、由良[9]和宮川等均是從溫州蜜柑中選育出來(lái)的不同熟期芽變品種。資源調(diào)查發(fā)掘野生和地方良種也是柑橘育種的有效途徑，資陽(yáng)香橙[10]即是從地方資源中選育出來(lái)的優(yōu)良柑橘砧木，馬家柚、琯溪蜜柚和安江香柚等均是從地方良種中發(fā)掘選育而成。受珠心胚干擾，柑橘雜交品種數(shù)量相對(duì)較少，愛(ài)媛28、沃柑、不知火和W莫科特等是國(guó)外選育的優(yōu)良雜柑品種，中國(guó)選育的金秋砂糖橘、大雅柑市場(chǎng)反映良好。其中，湖南通過(guò)芽變選種等手段選育出錦玉[11]、錦紅[12]、錦秀[13]和黔陽(yáng)冰糖臍橙[14]等冰糖橙品種，與普通冰糖橙相比果實(shí)品質(zhì)均有一定提升，對(duì)湖南柑橘品種結(jié)構(gòu)調(diào)整具有重要作用，現(xiàn)已得到大力推廣，獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益[15]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】紅肉柑橘因其色澤鮮艷而具有特殊的市場(chǎng)潛力，但目前還鮮見(jiàn)紅肉類(lèi)型冰糖橙品質(zhì)分析與遺傳鑒定的研究報(bào)道。從郴州某冰糖橙果園中篩選出冰糖橙紅肉芽變，經(jīng)初步觀察發(fā)現(xiàn)，該變異株系紅肉性狀穩(wěn)定，并對(duì)其果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行分析與汁胞紅色色素檢測(cè)以及遺傳變異分子標(biāo)記分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探明紅肉冰糖橙的品質(zhì)及遺傳變異狀況，以期為紅肉冰糖橙芽變品種的選育及其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果實(shí) 果實(shí)均為紅肉冰糖橙、普通冰糖橙和紅肉臍橙成熟鮮果，均于2018年11月24日采自湖南郴州，采集樣品時(shí)選樹(shù)齡、樹(shù)勢(shì)相對(duì)一致的成年結(jié)果樹(shù)，每株樹(shù)隨機(jī)采摘果實(shí)25個(gè)，采樣樹(shù)的砧木均為枳〔Poncirustrifoliata(L.) Raf〕；果實(shí)用于品質(zhì)及汁胞紅色色素分析。

1.1.2 樣品葉片 試驗(yàn)樣品紅肉冰糖橙為芽變甜橙，對(duì)照樣品普通冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙均為甜橙；樣品葉片用于遺傳鑒定，由國(guó)家柑橘改良中心長(zhǎng)沙分中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.3 儀器 U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立(中國(guó))有限公司；Infinite 200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀，瑞士帝肯(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)測(cè)定

1) 果實(shí)品質(zhì)。果實(shí)橫、縱徑及皮厚采用游標(biāo)卡尺測(cè)量；果實(shí)重量采用電子天平稱(chēng)量；果汁可溶性固形物含量采用手持測(cè)糖儀測(cè)定；可滴定酸含量用酸堿滴定法測(cè)定；維生素C含量參照文獻(xiàn)[16]的方法采用抗壞血酸標(biāo)定法測(cè)定。

可食率=(果實(shí)質(zhì)量-果皮質(zhì)量-種子質(zhì)量)/果實(shí)質(zhì)量×100%

出汁率=(果汁質(zhì)量/果實(shí)質(zhì)量)×100%

2) 汁胞紅色色素含量。β-胡蘿卜素和番茄紅素含量，參照文獻(xiàn)[17]的方法采用HPLC法測(cè)定。將柑橘汁胞凍干研磨成粉末，稱(chēng)取0.2 g樣品于15 mL離心管中，加入6 mL丙酮；用錫箔紙將離心管包住，封緊瓶蓋，冰浴超聲2 h，4℃、1 000 r/min離心10 min；取5 mL上清常溫濃縮，再加入500 μL丙酮復(fù)溶，4℃、1 200 r/min離心10 min；取20 μL上清HPLC液相分析。類(lèi)胡蘿卜素含量，參照文獻(xiàn)[18]的方法采用分光光度計(jì)法測(cè)定。將甜橙汁胞凍干，稱(chēng)取0.03 g樣品，加入3 mL 80%丙酮研磨成勻漿，將研磨液轉(zhuǎn)移到玻璃試管中；用2 mL 80%丙酮沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)移到玻璃試管中，重復(fù)沖洗3次，依次將沖洗液轉(zhuǎn)移到玻璃試管；加塞并用封口膜封緊，常溫下放暗處浸提48 h，至樣品褪去顏色發(fā)白為止；用80%丙酮定容至25 mL，搖勻，此液即為類(lèi)胡蘿卜素提取液。分別測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素提取液與80%丙酮在波長(zhǎng)663 nm、645 nm和470 nm下的吸光度，計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素含量。

1.2.2 遺傳變異分子標(biāo)記分析 采用改良CTAB法提取各甜橙的葉片DNA，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度和純度。從實(shí)驗(yàn)室柑橘分子數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選遺傳變異分子標(biāo)記鑒定位點(diǎn)，利用Primer 5設(shè)計(jì)引物(正向引物序列為GCCACAGAGCAGACAGGAA，反向引物序列為CACGGTGTCGAGGAGACTTT)，對(duì)紅肉冰糖橙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上120 V電泳40 min，結(jié)束后置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉冰糖橙的品質(zhì)

2.1.1 果實(shí)品質(zhì) 從表1可知，紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙橫徑、縱徑、單果重、皮厚和可食率的差異。橫徑和縱徑分別為65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；單果重為143.86～252.00 g, 依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；皮厚為3.28～3.96 mm，依次為普通冰糖橙>紅肉臍橙>紅肉冰糖橙；可食率為62.81%～65.90%，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；出汁率為41.95%～53.97%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；可溶性固形物為11.33%～12.53%，依次為普通冰糖橙>紅肉冰糖橙>紅肉臍橙；可滴定酸為0.20%～0.78%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；固酸比為14.53～58.30，依次為紅肉冰糖橙>普通冰糖橙>紅肉臍橙；維生素C為58.36～63.39 mg/100mL，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙。從圖1看出，紅肉冰糖橙與普通冰糖橙相比，果肉為紅色，果實(shí)相對(duì)較小，出汁率較低；與紅肉臍橙相比，紅肉冰糖橙在果梗及果皮白皮層處也有紅色著色。

表1 不同甜橙品種的果實(shí)品質(zhì)

圖1 不同甜橙品種的果實(shí)切面示意

2.1.2 汁胞紅色色素含量 從表2看出，紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙β-胡蘿卜素、番茄紅素和類(lèi)胡蘿卜素含量的變化。β-胡蘿卜素為3.34～70.98 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著；番茄紅素為0.74～3.19 μg/g，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著；類(lèi)胡蘿卜素為69.72～212.87 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著。

表2 不同甜橙品種汁胞紅色色素的含量

2.2 紅肉冰糖橙的遺傳鑒定

從圖2看出，引物合成后經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，紅肉冰糖橙在100～250 bp出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明其與普通冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙等對(duì)照在DNA水平存在差異，具有成為新品種的遺傳基礎(chǔ)。

注：2K為T(mén)rans 2K DNA Maker；1為紅肉冰糖橙，2～5分別為冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙(對(duì)照)。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)大規(guī)模種植的紅肉類(lèi)型甜橙主要是紅肉臍橙和血橙，2個(gè)品種果實(shí)酸度較高，果實(shí)成熟期均在12月以后，選育紅肉冰糖橙可讓紅肉類(lèi)型甜橙提早上市，搶占市場(chǎng)[5-6]。湖南通過(guò)芽變選種等手段選育出錦玉和錦紅等[11-14]冰糖橙品種，與普通冰糖橙相比果實(shí)品質(zhì)有一定提升，對(duì)湖南柑橘品種結(jié)構(gòu)調(diào)整具有重要作用[15]。紅肉冰糖橙果肉顏色與紅肉臍橙接近，其主要著色色素也是番茄紅素，初步推測(cè)紅肉冰糖橙果肉著色機(jī)理可能與紅肉臍橙相似[19]。研究結(jié)果表明，在紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙中，果實(shí)橫徑和縱徑分別為65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；皮厚為3.28～3.96 mm，依次為普通冰糖橙>紅肉臍橙>紅肉冰糖橙；可食率為62.81%～65.90%，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；可溶性固形物為11.33%～12.53%，依次為普通冰糖橙>紅肉冰糖橙>紅肉臍橙；維生素C為58.36～63.39 mg/100mL，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；可滴定酸為0.20%～0.78%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙。β-胡蘿卜素為3.34～70.98 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙；番茄紅素為0.74～3.19 μg/g，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；類(lèi)胡蘿卜素為69.72～212.87 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙；各品種間3種色素含量均差異顯著。引物合成后經(jīng)PCR擴(kuò)增，紅肉冰糖橙在100～250 bp出現(xiàn)特異性條帶，與普通冰糖橙在DNA水平存在差異。普通冰糖橙成熟期為11月下旬或12月上旬，紅肉冰糖橙成熟期為11月上中旬，略有提前，可提早采收期，錯(cuò)開(kāi)普通冰糖橙上市高峰期，有利于提高其經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

紅肉冰糖橙果實(shí)為紅肉、低酸、早熟、無(wú)籽或少籽，其品質(zhì)較普通冰糖橙明顯提升，引物合成后經(jīng)PCR擴(kuò)增，在100～250 bp出現(xiàn)特異性條帶，與普通冰糖橙在DNA水平存在差異，具有成為新品種的遺傳基礎(chǔ)。