黃 寧， 周建云， 趙一君， 周國林， 聶忠揚， 張翼飛，黃 翔， 劉勁松， 林 松， 張曉強

(1.貴州省煙草公司 貴陽市公司， 貴州 貴陽 550002； 2.中國煙草總公司 貴州省公司， 貴州 貴陽 550001)

0 引言

【研究意義】煙草(NicotianatabacumL.)是茄科煙草屬植物，全球約有120個國家和地區(qū)種植煙草，在我國煙草是重要的經(jīng)濟作物之一[1]。近年來，氣候環(huán)境的變化導致在煙草上出現(xiàn)的病害越發(fā)嚴重，嚴重威脅煙草種植業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。因此，研究防治煙草靶斑病的有效方法對促進煙草種植業(yè)穩(wěn)產(chǎn)增收意義重大?！厩叭搜芯窟M展】煙草靶斑病(Tobacco target spot)的病原為無性世代立枯絲核菌(Rhizoctoniasolan)，該病害 于2006 年在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并被報道，從煙草苗期至大田成熟期均可發(fā)生，侵染葉片的同時亦危害莖部。葉片受侵染后出現(xiàn)圓形水漬狀斑點，如遇溫度適宜、濕度大的環(huán)境，病斑則迅速擴展形成直徑2 ～ 20 cm有同心輪紋的不規(guī)則斑，病斑周圍有褪綠暈圈，病斑壞死部分易碎，形成穿孔，類似槍彈射擊在標靶上形成的空洞，故稱為靶斑病[2]。該病是我國近年來發(fā)生范圍較廣的煙草病害，在云南、湖南、吉林、黑龍江、廣西、遼寧等地均有發(fā)生，且來勢猛、流行快，連片發(fā)生、病情重，極大地影響烤煙產(chǎn)質(zhì)量，同時具有一定的傳染性，是應重點關注的煙草大田期病害之一[3]。為降低煙草行業(yè)由于該病害造成的損失，廣大科研人員對相關防治藥物進行了大量研究，但化學藥劑的大量使用會造成環(huán)境污染，以及產(chǎn)品農(nóng)殘的超標等問題。因此，在煙草病蟲害防控上，亟需探索一些安全、有效的綠色防控技術。近年來，作為現(xiàn)代植物病害防治的重要途徑之一，植物誘導抗病得到國內(nèi)外學者的廣泛關注[4-7]。植物誘抗劑通過調(diào)節(jié)植物的新陳代謝并激活其免疫系統(tǒng)提高植物的抗逆能力和抗病性，具有多抗、高抗和衛(wèi)生安全等優(yōu)點[8]。植物免疫誘抗劑是一類能夠誘導植物系統(tǒng)獲得抗性的化合物，一般分為有機酸類、無機化合物類、寡糖類和蛋白多肽類[9-10]，這些物質(zhì)能夠激活植物的免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)植物的新陳代謝過程，進而增強植物的抗病抗逆能力[5-11]。【研究切入點】化學殺菌劑在作物病害防控方面應用廣泛，但殺菌劑的長期使用難免產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題，不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。植物誘抗劑在誘導作物生長、提高抗病能力方面效果顯著，其使用量相對較低，對環(huán)境污染小，是減少化學農(nóng)藥使用量，促進作物提質(zhì)增效的重要手段。目前，有關誘抗劑對煙草靶斑病誘抗性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以貴陽市馮三鎮(zhèn)煙草種植基地分離獲得的靶斑病致病菌(Rhizoctoniasolani，WT)為試驗材料，研究黃腐酸、S-誘抗素、水楊酸、0.01%蕓苔素內(nèi)脂可濕性粉劑4種誘抗劑誘導煙草的抗病效果，為生產(chǎn)上防控該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 云煙87，煙草幼苗由開陽縣馮三鎮(zhèn)煙草育苗基地提供。

1.1.2 供試菌種 立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani，WT)，由貴州大學農(nóng)安實驗室提供。

1.1.3 供試藥劑 黃腐酸(有效成分≥95%)，購自德國阿格福萊農(nóng)林環(huán)境生物技術股份有限公司；S-誘抗素(天然脫落酸)，購自山東圣鵬科技股份有限公司；水楊酸(有效成分≥99.5%)，購自天津市光復精細化工研究所；0.01%蕓苔素內(nèi)脂可濕性粉劑，購自江蘇克勝集團股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 育苗 于2021年4月21日將煙株幼苗移栽至高18 cm、直徑20 cm的花盆中，澆足定根水，定期觀察煙株生長情況，待煙株長至50 cm時開始試驗處理。

1.2.2 誘抗劑處理 試驗共設黃腐酸2 000倍液、S-誘抗素30 000倍液、1 mmol/L水楊酸溶液、蕓苔素內(nèi)酯2 000倍液4個處理，并設置清水對照(CK)，每個處理10盆煙株。分別于6月15日、6月20日、6月25日將4種誘抗劑各均勻噴霧至煙葉表面，間隔5 d噴施1次，共噴施3次。

1.2.3 孢子懸浮液制備及接種 將煙草靶斑病致病菌WT接種至PDA平板培養(yǎng)基上，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中央長出孢子后，用無菌水將孢子洗脫，8層無菌紗布過濾，并將孢子懸浮液濃度調(diào)整為105個/mL，備用。于誘抗劑最后1次(6月25日)誘導2 d后，噴霧接種濃度為105個/mL的煙草靶斑病菌孢子懸浮液，為保證接種成功率，共接種2次致病菌孢子液，間隔1 d接種1次，接種后煙株保濕培養(yǎng)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 發(fā)病情況 待對照組出現(xiàn)明顯靶斑病癥狀時(7月15日)開始調(diào)查煙株發(fā)病情況，共調(diào)查2次，間隔15 d調(diào)查1次，記錄病情指數(shù)，煙草靶斑病病情分級標準及計算方法如下。

0級：無病斑；

1級：病斑面積占葉片面積的1%以下；

3級：病斑面積占葉片面積的1%～10%；

5級：病斑面積占葉片面積的11%～30%；

7級：病斑面積占葉片面積的31%～50%；

9級：病斑面積占葉片面積的51%。

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×該級代表值)]×100/(調(diào)查總葉數(shù)×最高級代表值)

誘抗效果= [(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%

1.3.2 煙株農(nóng)藝性狀 按照標準《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》(YC/T 142—1998)，于煙株打頂前調(diào)查統(tǒng)計株高、葉數(shù)、最大葉長和最大葉寬，打頂后測量莖圍和節(jié)間距。

1.3.3 生理生化指標 當對照組出現(xiàn)明顯靶斑病癥狀時開始檢測各處理煙株生理生化指標，取樣時隨機采摘各處理中部葉片3～5片煙葉，置于冰盒中并帶回實驗室立即檢測煙葉苯丙氨酸解氨酶(PAL)、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)、超氧化物氣化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和可溶性蛋白質(zhì)含量，MDA、POD、SOD、CAT及蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。相對電導率檢測方法[12]：先用自來水洗凈煙葉表面灰塵，再用蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干水分后，用小刀將煙葉切成適宜長度的長條?？焖俜Q取鮮樣3份，每份0.1 g，分別置于裝有10 mL去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞于室溫下浸泡12 h，用電導儀測定浸提取液電導率(R1)，然后沸水浴加熱30 min，冷確至室溫后搖勻，再次測定電導率(R2)。

相對電導率=R1/R2×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和DPS 7.05進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用DPS 7.05單因素試驗統(tǒng)計分析-Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘抗劑對煙草靶斑病的誘抗性

從表1看出，誘抗劑處理后，煙株病情指數(shù)均低于對照處理，表明誘抗劑誘導增強煙草對靶斑病菌的抗性。發(fā)病早期(7月15日)S-誘抗素的誘抗效果最佳，病情指數(shù)為2.08，誘抗效果為61.62%；水楊酸處理次之，病情指數(shù)為2.25，誘抗效果為58.49%；黃腐酸處理最差，誘抗效果僅44.46%。發(fā)病后期(8月30日)各誘抗劑的誘抗效果均呈下降趨勢，但仍以S-誘抗素的誘抗效果最好，為56.61%；水楊酸處理次之，為53.40%。綜上，4種誘抗劑均能誘導增強煙株對靶斑病菌的抗性，其中，S-誘抗素對煙草誘導抗病效果最佳。

表1 不同誘抗劑處理煙草靶斑病的誘抗效果

2.2 不同誘抗劑處理煙株的農(nóng)藝性狀

從表 2 看出，4種誘抗劑對煙草株高、莖圍、最大葉長和最大葉寬等農(nóng)藝性狀均有不同程度影響。其中，S-誘抗素處理煙株的農(nóng)藝性狀整體較好，S-誘抗素可明顯增加煙株的株高、葉數(shù)及節(jié)間距，分別較對照增加19.6%、24.3%和11.4%；水楊酸處理次之，對煙株株高影響較為明顯；黃腐酸和蕓苔素內(nèi)酯處理的效果較差。各誘抗劑處理后煙株的莖圍、最大葉長、最大葉寬與對照間差異均不顯著。

表2 不同誘抗劑處理煙株的農(nóng)藝性狀

2.3 不同誘抗劑處理煙株的生理生化指標

由表3可見，4種誘抗劑誘導后煙葉MDA含量均有所下降且均低于對照，其中S-誘抗素處理后煙葉MDA含量最低，僅5.71 nmol/g；水楊酸處理其次，為7.56 nmol/g，但二者間差異不顯著；與相對電導率變化趨勢一致，S-誘抗素及水楊酸處理后煙葉電導率均低于其他處理，表明誘抗劑處理后煙葉受病原菌侵染程度降低，煙葉細胞膜損傷程度較小。另外，誘抗劑處理后煙株防御酶活性均較對照處理明顯提高，其中S-誘抗素誘導后煙葉PAL、CAT和SOD防御酶活性顯著高于其他處理，分別較對照增加85.86%、42.77%和61.18%；水楊酸處理次之，PAL、CAT和SOD分別較對照增加63.34%、39.83%和44.43%；4種誘抗劑處理后煙葉可溶性蛋白含量均上升，其中S-誘抗素增加量最大，較對照增加55.24%；與其他誘抗劑處理相比，水楊酸對煙葉可溶性蛋白含量影響較小。綜合看，S-誘抗素對煙草防御酶活性影響最大，能顯著提高煙草對靶斑病的抗性，水楊酸處理次之。

表3 不同誘抗劑處理煙株的防御酶活性及生理指標

3 討論

植物免疫誘抗劑能誘導植物系統(tǒng)獲得抗病性，其本身不具有殺菌活性且用量少，可有效減少化學農(nóng)藥用量、降低環(huán)境壓力和緩解農(nóng)藥3R問題[13]。該試驗選用的4種誘抗劑均可有效降低煙草靶斑病的病情指數(shù)，增強煙草對靶斑病的抗性，其中S-誘抗素的誘抗效果最佳，為61.62%；水楊酸次之，為58.49%；蕓苔素內(nèi)酯和黃腐酸相對較差。

S-誘抗素存在于衰老的葉片組織、成熟的果實、種子及植物的莖、根等部位，是植物生長發(fā)育、成熟各階段的重要調(diào)控因子。S-誘抗素具有促進植物葉片脫落、芽和種子休眠、抑制植物細胞的分裂和延長、引起氣孔關閉、影響種子胚的發(fā)育、增加植物在生物和非生物脅迫下的抗逆性、影響性的分化等多方面的作用[14]。S-誘抗素在實際生產(chǎn)中主要用于提高作物在高溫、低溫、干旱和水澇等逆境下的生存能力[15-17]；提高作物對病原菌和害蟲的抗性，從而提高防治藥劑的藥效[18-20]；可延長鮮切花的花期[21]，促進氮磷鉀的吸收，提高作物產(chǎn)量。該研究發(fā)現(xiàn)，S-誘抗素通過提高煙葉防御酶活性，改善煙株農(nóng)藝性狀，顯著增強煙株對靶斑病菌的抗性。

水楊酸(Salicylic acid，SA)即鄰羥基苯甲酸，廣泛存在于植物體內(nèi)，目前已被證明能夠調(diào)節(jié)植物許多抗逆生理過程，如抗寒性、抗鹽性、抗病性、抗旱性以及抗熱性[22-23]，SA作為一種植物激素，在未來有可能成為植物抵御各種逆境脅迫，提高作物增收潛力的管理方式，具有廣闊的應用前景[24]；劉太國等[25]研究發(fā)現(xiàn)，應用外源SA可以比較有效地誘導煙草抗病品種對病毒病產(chǎn)生抗病性。趙明敏[26]研究表明，外源施加SA能有效增強煙草對普通花葉病的抗性。試驗結果表明，經(jīng)水楊酸誘導后煙葉防御酶活性顯著增加、MDA含量及相對電導率明顯降低，因此該處理煙株對致病菌的抵抗能力顯著增加。

蕓苔素內(nèi)酯是一種天然的植物甾醇類生長激素，廣泛存在于植物界，被國際上譽為第六大植物激素[27]。蕓苔素內(nèi)酯促進細胞伸長和分裂為基礎，調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成、維管束分化、生殖發(fā)育、開花和衰老及響應環(huán)境信號[28]，并且可以改善逆境下植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)，提高植物抗氧化酶活性[29]。外施蕓苔素內(nèi)酯能解除植物的光抑制現(xiàn)象，提高作物的凈光合速率，促進作物的生長和有機物的積累。研究發(fā)現(xiàn)，蕓苔素內(nèi)酯對煙草靶斑病的誘導抗病效果僅次于S-誘抗素和水楊酸處理，對煙株促生作用較好。

黃腐酸中的羥基、羰基、醇羥基、酚羥基等官能團，有較強離子交換和吸附能力，可以提高肥料利用率[30]。腐殖酸通過與銨結合形成腐植酸銨，能減少氨揮發(fā)，進而增加氮素有效性[31]。同時，腐殖酸與Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等高價陽離子結合，減少其與磷肥中 HPO42-、H2PO4-結合而造成沉淀機會，提高磷肥利用率[32]。研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酸能提高馬鈴薯幼苗的生物酶活性，促進其光合作用，提高作物的抗病能力[33]。趙世元[34]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施黃腐酸可提高煙草體內(nèi)POD、SOD、PAL和PPO活性，噴施10 mmol/L黃腐酸可提高煙草對青枯病抗病效果，改善煙株的農(nóng)藝性狀。黃腐酸可促進植物的生長、養(yǎng)分吸收及細胞伸長[35]，有效刺激烤煙根系生理活性，增強根系活力，促進烤煙根系生長[36]。研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酸能在一定程度上誘導增強煙草對靶斑病的抗病性，但效果相對較差。為提高誘抗劑對植物的誘導抗病作用，還需進一步研究不同誘抗劑組合的施用效果，深入研究其誘抗機理，并開展大田試驗，為促進優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供切實可行的植保技術。

4 結論

不同誘抗劑對煙草靶斑病的誘抗效果差異明顯，S-誘抗素和水楊酸誘導抗病效果較佳，分別為61.62%和56.61%。S-誘抗素可有效提高煙草對靶斑病的抗性，在降低煙葉病情指數(shù)的同時還能改善煙株農(nóng)藝性狀，進而提高煙葉產(chǎn)量。