代邦國，耿亞楠，翁玉楠，史懷平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

海藻作為飼料添加劑的一種，含有氨基酸、脂肪酸、藻多糖、維生素等多種高價值的營養(yǎng)成分。但目前海藻飼料的研究主要集中在其對動物生長發(fā)育和生產(chǎn)性能的研究，本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，添加3%的海藻不會影響山羊的生長性能、屠宰性能和肌肉品質(zhì)，但有改善血脂指標(biāo)以及肌肉與脂肪組織脂肪酸組成的潛力。山羊瘤胃作為一個厭氧的消化系統(tǒng)，瘤胃中的微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌和病毒等共同組成了復(fù)雜的微生物共生群落，良好的瘤胃菌群環(huán)境能提高反芻動物飼料轉(zhuǎn)換和營養(yǎng)吸收效率。瘤胃中微生物的多樣性對瘤胃的發(fā)育至關(guān)重要，不僅可以幫助宿主將難以消化的纖維素和半纖維素等物質(zhì)分解成微生物蛋白以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，同時在維持宿主消化道穩(wěn)態(tài)及免疫健康等方面也發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)旨在探究飼糧中添加海藻對山羊瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響，為海藻飼料的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年8-11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能奶山羊原種場進(jìn)行。選擇16只6月齡的西農(nóng)薩能奶山羊青年公羔(21.9±0.98 kg)。采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為對照組(C)和試驗(yàn)組(A)，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)2只公羔在一個圈內(nèi)。對照組羔羊飼喂TMR基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組羔羊飼喂TMR基礎(chǔ)日糧+3%海藻(Schizochytrium sp.，粗脂肪(EE)≥ 60%, DHA ≥ 12%; 天津奧特奇生物制品有限公司)。試驗(yàn)期共89d，其中預(yù)飼期5d，正飼期12周。每日8：00和16：00飼喂2次，自由飲水?；A(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 瘤胃液樣品采集

試驗(yàn)最后一天早晨7：30從每個重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選擇一只羔羊，即每組4只，共8只羔羊，通過真空泵采集瘤胃液。每只羊采集50 mL，迅速測定pH后，經(jīng)4層消毒紗布過濾，將濾液4 000 r/min離心15 min后取5 mL瘤胃液液氮速凍，之后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.3 DNA 抽提、PCR 擴(kuò)增和熒光定量

1.4 Miseq文庫構(gòu)建和測序

通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq測序。

1.5 生物信息分析及統(tǒng)計(jì)處理

利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的生信Usearch分析平臺對Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，使用RDP分類器classifier tool(http://rdp.cme.msu.edu/)對16s序列進(jìn)行物種分類注釋，最低分類到種水平，使用 Silva 數(shù)據(jù)庫(SSU123)比對，置信度閾值設(shè)置為 0.7。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，結(jié)果用 x±s表示，P<0.05表示差異顯著。利用R語言工具制作曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃微生物多樣性

2.1.1 瘤胃微生物測序深度和OTU分析 試驗(yàn)8個樣品共得到406 316條原始序列，平均每個樣品50 790±5 529條。對序列進(jìn)行優(yōu)化后按照97%相似度對序列進(jìn)行OTU聚類，其中有效序列278 740條，共聚類得到1 236條OTU。對OTU序列進(jìn)行物種注釋發(fā)現(xiàn)OTU序列共覆蓋20個門，41個綱，77個目，126個科，264個屬及447個種的細(xì)菌。對OUT序列進(jìn)行門水平核心物種分析(圖1A)，發(fā)現(xiàn)樣本量>4時，核心菌門為12，核心菌門不再隨樣本量增加而增加，表明測序樣本量充足(圖1B)。由稀釋性曲線圖可以看出，各樣本稀釋曲線均趨于平緩。當(dāng)原始序列數(shù)>20000時，得到的物種數(shù)量增加趨勢緩慢，說明在原始序列數(shù)>20000的測序深度條件下，測序結(jié)果可以覆蓋絕大多數(shù)的瘤胃微生物。同時在測序深度相同時，對照組相比于試驗(yàn)組可以覆蓋到更多的微生物。

圖1 Sobs曲線(a)和核心物種曲線(b)

2.1.2 瘤胃微生物群落α多樣性分析 α 多樣性分析是用來反映微生物群落的豐富度和多樣性，并可通過一系列的統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)對環(huán)境群落的物種豐富度和多樣性進(jìn)行估計(jì)分析。由表3可知，在瘤胃微生物群落α多樣性分析中，群落豐富度指數(shù)chao 1、ace海藻添加組顯著小于對照組(<0.05)，表明海藻添加組瘤胃微生物群落豐富度顯著低于對照組；群落多樣性指數(shù)Simpsen、shannon和群落均勻度指數(shù)shannoneven兩組差異不顯著(>0.05)，群落覆蓋度指數(shù)Coverage指數(shù)兩組均大于99%。

表2 飼糧中添加海藻對西農(nóng)薩能奶山羊公羔瘤胃微生物α多樣性指數(shù)的影響

2.2 瘤胃微生物物種組成分析

圖2為門水平上兩組共有微生物群落分布圖。占菌群種類總數(shù)1%以上的有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等，分別占菌群總數(shù)的54.03%、37.44%、1.88%、1.58%、1.4%和1.0%。其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占菌群總數(shù)的91%以上，是瘤胃中最重要的菌門。

圖2 門水平上兩組共有微生物群落分布圖

2.3 瘤胃微生物比較分析

圖3a中Stress<0.05，表明該NMSD結(jié)果有很好的代表性。A組和C組的各自的4個樣本點(diǎn)互相接近，且通過分組橢圓可以將兩組樣本清晰的分開，分組橢圓無交叉。圖3b中兩組樣本OTU水平聚類效果明顯。均表明兩組組內(nèi)樣本組成相似，樣本間差異明顯。

圖3 瘤胃微生物比較分析

在門水平上，由圖4a可以看出添加海藻的試驗(yàn)組纖維桿菌門(Fibrobaceters)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)相對豐度顯著低于對照組(<0.05)，其余菌門差異均不顯著(>0.05)。在屬水平上，由圖4b可以看出添加海藻的試驗(yàn)組未知屬型擬桿菌BS11(norank_f__Bacteroidales_BS11_gut_group)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和瘤胃球菌屬_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)相對豐度顯著低于對照組(<0.05)。

圖4 門水平(a)和屬水平(b)上的物種差異分析

3 討 論

青年羊瘤胃占全胃的比例在60%左右，飼糧對瘤胃內(nèi)發(fā)酵主要是通過影響瘤胃菌群區(qū)系或功能來實(shí)現(xiàn)。腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門有利于動物消化植物來源的食物，較高含量的厚壁菌門和擬桿菌門是植食性動物腸道微生物群落的典型特征。曾燕等報道蒙古羊瘤胃中主要優(yōu)勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。索效軍等報道的湖北黑頭羊中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占菌群總數(shù)的90%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，奶山羊瘤胃中擬桿菌門(Bacteroidetes,54.03%)和厚壁菌門(Firmicutes,37.44%)占菌群總數(shù)的91%以上，與上述結(jié)果一致，表明飼糧中添加海藻不會改變山羊瘤胃中的主要優(yōu)勢菌門。

海藻中富含多糖類、多酚類等生物活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化活性和抗菌活性，能有效抑制和清除動物體內(nèi)活性氧自由基。抑菌相關(guān)試驗(yàn)表明藻類中的一些成分可以減少細(xì)菌、原生動物、古細(xì)菌、真菌的復(fù)雜瘤胃微生物群。白建等選取1日齡體重相近的AA肉雞，發(fā)現(xiàn)添加海藻粉和抗菌肽降低了21和42日齡肉雞盲腸大腸桿菌的數(shù)量。Leonard 等研究發(fā)現(xiàn)添加海藻提取物后仔豬結(jié)腸大腸桿菌種群和腸桿菌科數(shù)量顯著減少，結(jié)腸中具有更高水平的黏蛋白 MUC2 m RNA 豐度。本試驗(yàn)在山羊飼糧中添加3%海藻，瘤胃中纖維桿菌門(Fibrobaceters)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)豐富度指數(shù)chao 1和ace顯著降低，與上述結(jié)果一致，表明添加海藻降低了山羊瘤胃微生物群落的豐富度，可能原因是海藻中多糖和多酚等物質(zhì)的抑菌作用引起的。

瘤胃球菌屬是消化球菌科(Peptoeaccaeeae)的革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，其下的兩個種白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和屬于纖維桿菌門的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是現(xiàn)今公認(rèn)的瘤胃三大優(yōu)勢纖維分解菌。白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌均能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，是降解木聚糖主要的細(xì)菌。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌能產(chǎn)生高水平的內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，是降解重鈣化纖維素，如棉花粗纖維素的重要細(xì)菌。Zeng等在山羊日糧中添加烷基多糖苷后改變了瘤胃細(xì)胞膜上的脂肪酸組成，降低了白色瘤胃球菌的數(shù)量。這與本試驗(yàn)添加海藻后瘤胃球菌屬_NK4A214(_NK4A214_group)顯著下降的結(jié)果一致，推測可能原因是由于海藻中一些多糖類作用引起的。李旦等發(fā)現(xiàn)在肉牛瘤胃日糧中添加4%的豆油和胡麻油可以顯著減少瘤胃中纖維分解菌，表明飼糧中植物油脂中某些脂肪酸可能對纖維分解菌有抑制作用。孫云章等研究表明，隨著精料比例的增大, 瘤胃真菌數(shù)量逐漸降低直到消失, 細(xì)菌數(shù)量逐漸上升，當(dāng)精料增加到一定水平時，瘤胃內(nèi)的低 pH 環(huán)境最終會抑制纖維降解菌的生長。柳君輝等發(fā)現(xiàn)，高精料模式下肉牛瘤胃中門水平上的纖維桿菌數(shù)量下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加3%海藻可以顯著降低山羊未知屬型擬桿菌BS1(norank_f___BS11_gut_group)、纖維桿菌屬()，可能原因是海藻中豐富的脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)抑制了山羊瘤胃中的纖維素降解菌的數(shù)量。層級聚類和NMSD分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可通過比較瘤胃微生物進(jìn)而區(qū)分試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組又以某種新的相似性而獨(dú)自聚合，表明飼糧中添加海藻可以顯著影響山羊瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)，使其具有新的群落特點(diǎn)。綜上所述，添加海藻對山羊瘤胃微生物區(qū)系具有顯著的影響，更深入的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

飼糧中添加海藻顯著影響青年山羊瘤胃群落結(jié)構(gòu)，降低瘤胃微生物群落豐富度，降低了瘤胃中纖維桿菌和瘤胃球菌等主要纖維降解菌的相對豐度。