張璇，蔣偉勤，羅玲，劉新錢，韋東敏，周超，郭立

(1.廣西大學(xué) 土木建筑工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.柳州工學(xué)院 設(shè)計藝術(shù)學(xué)院，廣西 柳州 545616；3.廣西柳州鋼鐵集團焦化廠，廣西 柳州 545002；4.寶武水務(wù)科技有限公司，上海 201900)

據(jù)不完全統(tǒng)計，中國每年有超過2.5億t的焦化廢水產(chǎn)生[1]，而其中所包含的氨、酚、氰化物和多環(huán)芳烴等多種有毒污染物，讓其成為了最難處理的廢水之一[2]。近年來，國內(nèi)外科研人員開發(fā)出了O/H/O(好氧-水解-好氧)、A/A/O/O(厭氧-缺氧-好氧-好氧)和A/O/A/O(缺氧-好氧-缺氧-好氧)等幾種各具特點的生物工藝，使焦化廢水處理降本增效非常明顯[3-5]。其中，AOAO工藝因為具有較高的脫氮和解毒能力，受到了廣泛的關(guān)注。本研究通過監(jiān)測AOAO工藝中焦化廢水理化性能參數(shù)的變化，并結(jié)合宏基因組測序分析AOAO系統(tǒng)微生物演替規(guī)律，為焦化廢水處理系統(tǒng)污染物控制策略的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 全規(guī)模焦化廢水處理系統(tǒng)

廣西柳州鋼鐵集團有限公司于2019年完成了焦化廠原有單極AO廢水處理系統(tǒng)的提質(zhì)改造，新增了第二級AO處理裝置。升級后的焦化廢水處理系統(tǒng)已穩(wěn)定運行近3年，每天可處理焦化廢水水量160～180 m3/h。系統(tǒng)工藝流程見圖1。原混合廢水先經(jīng)過除油池、調(diào)節(jié)池等預(yù)處理后，被回流水稀釋以減少對微生物的毒性作用，之后進入AOAO生物處理系統(tǒng)。根據(jù)實際運行效果和前期研究[6]，一級污泥回流比設(shè)定為180%～200%，回流水占進水比為120%～150%，二級污泥回流比130%～150%。生物處理后經(jīng)混凝沉淀物化處理，出水水質(zhì)符合我國焦化行業(yè)執(zhí)行的《煉焦化學(xué)工業(yè)污染物排放標(biāo)準》(GB 16171—2012)。

1.2 理化性質(zhì)的檢測

2021年6月，在柳鋼集團焦化廠相關(guān)人員的幫助下，每天早、中、晚連續(xù)采集生化反應(yīng)器進水及AOAO反應(yīng)器出水廢水樣品，監(jiān)測理化性質(zhì)?；瘜W(xué)需氧量(HJ 828—2017)、氨氮(HJ 535—2009)、總氮(HJ 636—2012)、硝酸鹽氮(《水和廢水監(jiān)測分析方法》第3版)[7]、亞硝酸鹽氮(GB 7493—87)、氰化物(HJ 484—2009)、揮發(fā)酚(HJ 503—2009)和硫化物(GB/T 16489—1996)采用各自的標(biāo)準方法進行測量。通過三價鐵絡(luò)合分光光度法測定硫氰酸鹽含量。采用PHS-3C酸度計測量廢水的pH值。使用二氯甲烷萃取焦化廢水中多環(huán)芳烴，萃取液通過CNW Florisil固相萃取柱凈化，用二氯甲烷和正己烷的混合溶劑(1∶1)洗脫，洗脫液旋蒸濃縮后，用Agilent，7890B—5977B氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測。

1.3 DNA提取和微生物測序分析

焦化廢水樣品于2021年6月分別從生物反應(yīng)器A1、O1、A2和O2中采集1次，在提取DNA前儲存于-20 ℃的低溫冰箱中。DNA提取是通過使用Omega Bio-tek DNA試劑盒進行的。使用TBS-380微型熒光計檢測DNA樣品的濃度，純度則由NanoDrop 2000分光光度計測試。利用瓊脂糖凝膠電泳(濃度為1%)檢測抽提的DNA完整性。通過Covaris M220超聲破碎儀將DNA片段化，篩選出400 bp左右的片段，用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq試劑盒構(gòu)建PE文庫，隨后在Illumina NovaSeq平臺上進行宏基因組測序。獲得測序數(shù)據(jù)采用與Speth相同的方法進行質(zhì)控、組裝、比對等分析工作[8]。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗收集的數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2016和SPSS 26.0進行統(tǒng)計分析。理化指標(biāo)表示為平均值加減標(biāo)準差。生物信息學(xué)相關(guān)比對分析在美吉云平臺上進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 AOAO工藝的理化特性

通過考察AOAO生物處理過程中化學(xué)需氧量、總氮、揮發(fā)酚和多環(huán)芳烴等11項焦化廢水理化指標(biāo)的變化(表1)，研究了AOAO工藝的運行性能。

表1 AOAO處理系統(tǒng)中焦化廢水的理化性質(zhì)

2.1.1 COD去除性能 生物反應(yīng)器進水的COD為(4 601±385)mg/L，O1出水和O2出水的COD分別為(635±98)mg/L和(244±25)mg/L，一級AO和二級AO的平均COD去除率分別為86.2%和61.6%。高去除率表明生物處理在COD去除中發(fā)揮了重要作用。兩級AO具有足夠長的水力停留時間(>150 h)，保證了大多數(shù)可生物降解有機物的高效去除。O2中殘留的有機物來自焦化廢水中的有毒大分子有機物或惰性有機物。生物處理階段出水COD通常在200～300 mg/L，出水仍含有相對較高的難降解有機污染物。因此，殘余COD利用后續(xù)物化處理工藝進一步去除。

2.1.3 有毒污染物的去除性能 揮發(fā)酚是焦化廢水中的一類主要污染物，包括苯酚、甲酚、二甲酚和硝基酚等高毒物質(zhì)。其中苯酚是最豐富的揮發(fā)酚，占比50%以上。進水揮發(fā)酚濃度為(740±68)mg/L，A1O1的揮發(fā)酚去除率高達99.9%，O2出水平均值僅 0.04 mg/L，遠低于0.30 mg/L的國標(biāo)(GB 16171—2012)限值。在A1中，缺氧微生物可直接或間接利用廢水中的苯酚、對甲酚等作為內(nèi)部碳源和能源，實現(xiàn)酚類化合物的高效降解。此前有報道稱，采用序批式反應(yīng)器(SBR)處理含苯酚400 mg/L的合成廢水時，觀察到苯酚可以在不抑制COD和氨氮降解的情況下幾乎被完全去除(生物降解率99%)[10]。與一級AO相比，流入A2O2反應(yīng)器之前，氰化物、硫化物和硫氰酸鹽的濃度顯著降低。氰化物對大多數(shù)微生物來說是一種已被證實的毒素[11]。90.9%以上的氰化物在一級AO中被去除，從而降低了對二級AO的毒性負荷，毒性的降低又會促進A2和O2中頑固有機污染物降解細菌的增殖。

多環(huán)芳烴(PAHs)作為焦化廢水中優(yōu)先控制的持久性有機污染物，進水的總濃度高達(1 453±122)μg/L。O1和O2出水中PAHs的總濃度分別降至(516±67)μg/L和(40±8)μg/L，平均去除率分別為64.5%和92.2%。經(jīng)過AOAO處理后出水的PAHs平均濃度低于中國和歐盟的排放標(biāo)準限值(0.05 mg/L)。這表明生物強化兩級AO工藝在降解焦化廢水PAHs方面，表現(xiàn)出良好的去除性能。雖然PAHs可能經(jīng)歷吸附、揮發(fā)、光解和化學(xué)降解，但微生物降解是主要的降解形式。生物降解速率取決于溫度、pH值、氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)可及性、微生物種群和細胞運輸特性等因素[12]。PAHs的生物降解在缺氧和好氧條件下都能被觀察到。在缺氧環(huán)境中，PAHs可在硝酸鹽和硫酸鹽還原條件下部分降解，形成低分子量有機酸作為配體與重金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，最終還原菌可利用活化的重金屬并達到強化降解PAHs的目的[13]。在好氧環(huán)境中，微生物通過兩種途徑降解PAHs。一種是真菌在其胞內(nèi)單加氧酶作用下進行，另一種是細菌在雙加氧酶作用下逐步完成。初始階段都是依靠加氧酶的作用把氧原子加到碳鏈上，再經(jīng)過加氫、脫水等作用使烴鏈斷開，苯環(huán)數(shù)減少[14]。加氧酶同時能被其他底物(如添加的碳源)誘導(dǎo)，活性提高而使降解作用增強。不同的途徑產(chǎn)生不同的代謝物，這些物質(zhì)通過降解都能被微生物(包括真菌和細菌)利用合成細胞蛋白，最后產(chǎn)物是CO2和H2O[15]。

2.2 AOAO工藝中微生物群落的演變

為了了解生物反應(yīng)器AOAO中的微生物群落演替規(guī)律，分別在門、綱和屬水平上分析了分類操作單元(OTUs)的數(shù)量。

2.2.1 細菌群落門水平分析 由圖2可知，焦化廢水中五個最具優(yōu)勢的門依次是Proteobacteria(變形菌門，平均占比62.3%，每個反應(yīng)器55.8%～80.5%)、Bacteroidetes(擬桿菌門，平均占比18.2%)、Ignavibacteriae(懶桿菌門，平均占比4.41%)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門，平均占比3.38%)和Acidobacteria(酸桿菌門，平均占比2.41%)，它們在四個不同的生物反應(yīng)器中總占比將近90%。這與之前的研究一致，即Proteobacteria和Bacteroidetes是不同焦化廢水廠污水或污泥樣本中最豐富的兩大細菌門[16-17]。據(jù)報道，Proteobacteria在焦化廢水中主要參與難降解有機化合物(如苯酚、多環(huán)芳烴和含氮雜環(huán)化合物)的脫氮和生物降解[18]。Bacteroidetes廣泛參與蛋白質(zhì)、纖維素和聚合碳水化合物的降解[19]。Ignavibacteriae處于O1有氧環(huán)境時，所占比例從0.96%提升至4.78%，部分優(yōu)勢菌能夠進行有氧呼吸，能以氧化方式分解糖類等碳源作為能量來源。Nitrospirae也生活在有氧的環(huán)境中，以氧作為最終電子受體，主要功能是保證硝化作用的正常進行。Acidobacteria一般具有較強的代謝碳水化合物能力，即使在偏堿性的焦化廢水中始終占有一定的比例。

圖2 焦化廢水中細菌群落百分比餅圖(門水平)Fig.2 Percentages of bacterial community in coking wastewater (phylum level)

2.2.2 細菌群落綱水平分析 在綱水平上，Betaproteobacteria(β-變形菌綱)在四個反應(yīng)器中均是最大的類別，其包括很多好氧或兼性細菌，所占百分比從26.4%到61.1%。β-變形菌具有突出的降解多種污染物的能力，除了廣泛分布于焦化廢水生物反應(yīng)器中，在含酚廢水、生活污水等生物處理系統(tǒng)中也被大量檢測到[20-21]。變形菌門的另兩個菌綱，Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)和Gammaproteobacteria(γ-變形菌綱)也具有明顯優(yōu)勢，平均占比分列二、四位，分別為13.2%和6.34%，同時它們也是其他工業(yè)廢水處理系統(tǒng)的主要菌綱[22]。第三大類Flavobacteria(黃桿菌綱)很早就被報道有能力分解多環(huán)高分子有機物，如木質(zhì)素及其衍生物[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)Flavobacteriumsp.在氮源和硫源充足的條件下，能表現(xiàn)出很高的脫色活性，說明Flavobacteria可能在焦化廢水的生物降解脫色中發(fā)揮著積極作用[24]。

2.2.3 細菌群落屬水平分析 在屬水平上，AOAO共檢測到3 993個OTUs。利用Venn圖分析不同反應(yīng)器的物種分布情況，由圖3可知，四個反應(yīng)器被檢測到的OTUs數(shù)量有所差別。O1最小為3 444，在A2中由于碳源的加入，微生物營養(yǎng)供給充足，OTUs數(shù)顯著增至最大值3 623，可見A2的細菌群落最豐富?？傮w來看，二級AO細菌群落豐富度高于一級AO。所有樣品中共有3 043個相同的OTUs樣本，占總數(shù)的76.2%，說明不同生物反應(yīng)器的細菌群落組成較一致。A1中有169個特有OTUs，O1有35個，而A2、O2獨有的屬只有19和23個，表明細菌群落多樣性隨著生物反應(yīng)進程而顯著降低，二級AO逐漸形成了一個穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)，這有利于AOAO工藝保持長期穩(wěn)定的運行性能。

圖3 細菌OTUs分布Venn圖(屬水平)

AOAO過程的優(yōu)勢菌屬，它們的出現(xiàn)率和比例在一級AO與二級AO中是不一致的。Diaphorobacter(硝基黃桿菌屬)在A1O1中占有絕對優(yōu)勢(A1：12.82%，O1：7.38%)。Diaphorobacter對有毒有機污染物，尤其是酚類化合物和多環(huán)芳烴，能夠進行高效的生物降解[25]。另一優(yōu)勢菌Acidovorax(食酸菌屬，A1：7.12%，O1：3.65%)被報道具有氧化砷、溶解銅的能力[26-27]。一級AO偏中性的pH環(huán)境有助于富集Acidovorax，進而有利于焦化廢水中重金屬的轉(zhuǎn)化去除。Han等通過促進Acidovorax細胞內(nèi)外的電子轉(zhuǎn)移，從而促進其代謝，增強有機物和類蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的降解[28]。值得注意的是，A1O1優(yōu)勢菌種之間的差異性明顯大于A2O2。A1中突出的Thauera(陶厄氏菌屬)百分比達10.05%，O1中則是Thiobacillus(硫桿菌屬：6.77%)占優(yōu)。相比之下，A2O2優(yōu)勢菌屬分布較一致，占比較大的同為Hyphomicrobium(生絲微菌屬，A2：6.87%，O2：7.40%)和Nitrospira(硝化螺旋菌屬，A2：2.69%，O2：2.65%)。

具體來看，在先前的研究中，Thauera已被確定為焦化廢水中的主要兼性脫氮菌，其可以利用碳源(如芳烴、酚類或甲醇)作為電子供體完成反硝化反應(yīng)[29]。毛躍建從反硝化池樣品中分離出三株Thauera菌株，發(fā)現(xiàn)它們可以降解吲哚、苯酚、甲酚及二甲酚等多種有機污染物[30]。豐富的Thiobacillus被認為是含酚廢水的特征，尤其是在焦化廢水處理系統(tǒng)中普遍存在[31]。Thiobacillus不僅具有降解苯酚的能力，還負責(zé)硫氰化物的生物降解。本研究一級AO對焦化廢水中硫氰酸鹽的去除率高達96.7%，這可能歸功于O1的優(yōu)勢菌屬Thiobacillus。特別關(guān)注到，Hyphomicrobium在A2O2中的平均豐度為7.14%，遠高于一級AO。Hyphomicrobium可以利用甲醇、甲胺等C1化合物作碳源和能源，通常被認為是以甲醇為碳源的反硝化系統(tǒng)的主要參與者[32]。這表明Hyphomicrobium對二級AO反硝化脫氮過程有重要的促進作用。在A1O1中，氨的消耗量很大，硝酸鹽在O1中積累，Nitrospira開始富集。Nitrospira是焦化廢水硝化過程中最主要的亞硝酸鹽氧化菌[29]。二級AO中及時補充碳源，維持Nitrospira的生長繁殖，使Nitrospira的分布優(yōu)勢繼續(xù)保持，更有利于硝化過程，最終提升總氮的去除率。

3 結(jié)論

(1)AOAO工藝具有突出的脫氮和去除有毒污染物的性能。經(jīng)過AOAO生物處理，焦化廢水中揮發(fā)酚、總氮和多環(huán)芳烴的濃度均小于國家標(biāo)準(GB 16171—2012)排放限值。

(2)在AOAO處理過程中，優(yōu)勢菌屬Diaphorobacter和Thiobacillus等表現(xiàn)出良好的降解多種污染物的能力；Nitrospira、Thauera和Hyphomicrobium等功能微生物在脫氮中發(fā)揮著重要作用。

(3)二級AO細菌群落豐富度升高而多樣性降低，這有利于AOAO工藝處理系統(tǒng)保持長期穩(wěn)定的運行性能。