班紫妍， 劉長富， 劉夢娜， 宋 敏

兒童支氣管哮喘具有發(fā)病率高、容易反復(fù)發(fā)作的特點[1]。支氣管哮喘的病因主要在于氣管等慢性炎性反應(yīng)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，從而引起氣道狹窄或痙攣使氣道出現(xiàn)不完全可逆性氣流受限，進而引發(fā)支氣管哮喘。支氣管哮喘可引起炎性介質(zhì)等細(xì)胞因子水平升高，機體免疫功能異常，支氣管哮喘患兒易于繼發(fā)感染[2]。臨床資料顯示，在支氣管哮喘合并感染患兒中，以肺部感染所占比例最高，而肺部感染可破壞氣道上皮細(xì)胞，造成氣道損傷，致使呼吸道管腔變窄，加重氣道高反應(yīng)性，這也是導(dǎo)致患兒支氣管哮喘反復(fù)發(fā)作的主要原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強度，其數(shù)量及功能的異常與感染引起的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[4]。有報道稱，在調(diào)控T淋巴細(xì)胞分化中Notch信號通路發(fā)揮重要的作用[5]。Notch信號通路是高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前該通路在肺部感染對支氣管哮喘患兒的影響尚無報道。本研究分析肺部感染對支氣管哮喘患兒免疫紊亂的影響并對其相關(guān)機制進行初步研究，為臨床防治支氣管哮喘合并肺部感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月—2019年2月于四川省內(nèi)江市中醫(yī)醫(yī)院就診的支氣管哮喘合并肺部感染患兒70例作為感染組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②肺功能指標(biāo)第1秒用力呼氣容積（FEV1）占預(yù)計值百分比在30%～80%；③肺部感染符合《美國急性病醫(yī)院預(yù)防醫(yī)院感染策略綱要（2014更新版）》[7]；④年齡3～10周歲；⑤合并呼吸道病毒感染患兒（包括流感病毒 A 型、流感病毒 B 型、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴隨有血液系統(tǒng)、肝腎功能障礙以及惡性腫瘤的患兒；②就診前2周服用影響免疫功能藥物的患兒；③合并免疫功能缺陷、有呼吸衰竭史患兒；④合并精神疾病的患兒。選擇同期經(jīng)接受支氣管哮喘治療但并未合并肺部感染的支氣管哮喘患兒84例作為未感染組。另納入65例同期于我院體檢健康兒童作為對照組。所有入組者的監(jiān)護人均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)展開。

1.2 方法

1.2.1 基本參數(shù)收集 收集入組者性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、收縮壓等臨床基本參數(shù)，所有受檢者禁食8 h后抽取靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4℃、3 000 r/min離心15 min，血清通過全自動生化分析儀（美思康 MC6600）檢測其白蛋白（Alb）、血鈣（Ca）、血磷（P）、肌酐（Cr）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（FPG）、尿素（BUN），比濁法檢測尿白蛋白/肌酐（UACR）。

1.2.2 ELISA法檢測血液炎性因子 檢測前禁水禁食8 h，于次日清晨抽取肘靜脈血3～5 mL，常溫放置1 h，2 500 r/min離心15 min，取血清分裝于無菌EP管內(nèi)，置于-80℃保存，采用ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和IL-10的水平，試劑盒均采購自北洋百川生物科技有限公司，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 肺功能檢測 采用德國耶格BEI-159肺功能檢測儀進行肺功能檢測，肺功能指標(biāo)包含用力肺活量（FVC）、FEV1、用力肺活量比值（FEV1/FVC）、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比即一秒率（FEV1%）。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、Treg細(xì)胞水平 取患兒空腹靜脈血5 mL放入EDTA抗凝管中，一次加入抗體（FITC抗人IL-17 mAbIgG、FITC 抗人CD25mAb）10 μL，室溫下避光孵育30 min，然后加入200 μL溶血素避光放置15 min，裂解紅細(xì)胞。3 000 r/min離心5 min，用PBS重懸后再離心洗滌2次，沉淀底物100 μL的1%多聚甲醛溶液固定，流式細(xì)胞儀檢測Treg、Th17細(xì)胞水平。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測外周血單核細(xì)胞Notch1、Hes1的mRNA表達(dá) 治療前后，采集患兒清晨外周血并分離單核細(xì)胞，TRIzol試劑提取總RNA，用 DNA/RNA 測量儀測得RNA濃度。取符合要求的RNA樣本，采用qRT-PCR 法擴增 Notch1 mRNA、Hes1 mRNA。按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書進行擴增。擴增結(jié)束后，產(chǎn)物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳20 min，PUX Mix Marker 作為分子量參照物同時電泳，引物序列為Notch1（上游 5'-ACTGAGCAAGCTTGGCCCAGGACA-3'，下游 5'-TAGCCTCGCCAGAATTGTGA-3'），Hes1 （上游5'-ATGAAGCCGAACAGTTGTGC-3'，下游5'-GTCGTAAACCCGTACGGAGA-3'），以β-actin（上游5'-GCTGATCGACGGATCCATAT-3'，下游 5'-GGGTGATCCGTGGTTCAACT-3'）為內(nèi)參，在凝膠成像分析儀的紫外光下采集圖像，采用 Gepro 4.2 軟件分析目的基因與同一條帶β-actin的光密度比值。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0，符合正態(tài)分布的計量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，采用Pearson進行相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料對比

三組入組者年齡、性別、BMI、收縮壓和舒張壓等一般資料及血液生化指標(biāo)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），未感染組與感染組患兒病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），三組間具有可比性，見表1。

表1 三組入組者一般資料對比Table 1 Clinical data compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.2 肺功能情況對比

感染組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC以及FEV1%明顯低于未感染組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；未感染組FEV1、FVC、FEV1/FVC以及FEV1%明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組肺功能情況比較Table 2 Pulmonary function compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.3 細(xì)胞因子的對比

與對照組相比，未感染組和感染組患兒血清IL-17、TGF-β水平明顯升高，血清IL-10水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；感染組變化更明顯，與未感染組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組細(xì)胞因子比較Table 3 Serum level of cytokines compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.4 Th17、Treg細(xì)胞水平比較

與對照組相比，未感染組和感染組Treg細(xì)胞比例明顯降低，Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值明顯升高；感染組變化更明顯，與未感染組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組Th17、Treg細(xì)胞水平比較Table 4 Th17/Treg cell compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.5 外周血單核細(xì)胞Notch1、Hes1的mRNA表達(dá)

感染組患兒Notch1 mRNA、Hes1 mRNA表達(dá)水平明顯高于未感染組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），未感染組Notch1 mRNA、Hes1 mRNA明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表5。

表5 三組Notch1 mRNA、Hes1 mRNA表達(dá)水平比較Table 5 Expression levels of Notch1 mRNA and Hes1 mRNA compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.6 相關(guān)性分析

對 Notch1 mRNA、Hes1 mRNA與Th17、Treg細(xì)胞比例進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，Notch1 mRNA、Hes1 mRNA與Th17細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r=12.356，P＜0.01），與Treg細(xì)胞比例呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-11.458，P＜0.01），見圖2。

3 討論

兒童支氣管哮喘是兒科常見疾病，其病程較長，易發(fā)生并發(fā)癥[8]。支氣管哮喘患兒處于局部炎癥反應(yīng)時期，肺部黏膜保護機制受到破壞，防御能力減弱，病原菌穿透黏膜屏障易位，從而誘發(fā)感染[9]。即使臨床對于支氣管哮喘患兒肺部感染已經(jīng)重視并采取預(yù)防控制，但該類患兒仍是肺部感染的高發(fā)人群[10]。本研究結(jié)果顯示，感染組肺功能指標(biāo)明顯低于未感染組，說明在這兩種呼吸系統(tǒng)疾病共同作用下，會加重患兒的臨床癥狀，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展與免疫紊亂密切相關(guān)，而病原菌的直接侵害也會影響機體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致異常和慢性的炎癥反應(yīng)，但肺部感染對支氣管哮喘患兒炎癥-免疫的影響研究較少，因此，從此方面對上述患兒進行研究，以期為臨床的預(yù)防和治療工作提供參考。

近年來研究表明，Th17和Treg細(xì)胞屬于CD4+T 細(xì)胞亞群，二者在生理功能上相互制約，共同參與調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[11]。當(dāng)機體處于穩(wěn)態(tài)時，T細(xì)胞趨于向Treg細(xì)胞方向分化，維持免疫耐受。當(dāng)發(fā)生炎性反應(yīng)或感染時，免疫系統(tǒng)激活，誘導(dǎo)T細(xì)胞向 Th17 細(xì)胞分化，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]。本研究中支氣管哮喘患兒Treg細(xì)胞比例均明顯低于對照組，而Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值明顯升高，提示支氣管哮喘加劇Th17和Treg細(xì)胞平衡向Th17轉(zhuǎn)化，從而參與氣道及全身炎性反應(yīng)。Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的輔助性淋巴細(xì)胞亞群，因分泌細(xì)胞因子IL-17而命名。IL-17可誘導(dǎo)IL-6、GM-CSF等基因的表達(dá)從而增強TNF-α介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，還可通過刺激巨噬細(xì)胞釋放促炎因子加劇氣道的炎癥程度[13]，還可趨化中性粒細(xì)胞進入肺組織釋放彈力蛋白酶破壞肺組織[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染可增加小鼠肺臟Th17水平，且IL-17可以在一定程度評價感染程度[15]。Treg細(xì)胞與其他CD4+T細(xì)胞不同，是一類具有抑制炎性反應(yīng)作用的CD4+T細(xì)胞，在支氣管哮喘黏膜組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[16]。其分泌的TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子可以抑制巨噬細(xì)胞、Th細(xì)胞釋放促炎因子，從而抑制炎性反應(yīng)的產(chǎn)生及維持人體的免疫耐受[17]。報道稱，肺部感染患兒血清IL-17水平明顯高于正常人群[18]。本研究通過對穩(wěn)定期支氣管哮喘患兒Th17、Treg T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的測定，探討肺部感染對患兒全身系統(tǒng)炎癥的影響，結(jié)果顯示，肺部感染患兒IL-17、Th17及Th17/Treg比值均明顯高于未感染患兒，IL-10、TGF-β、Treg均明顯下降，說明肺部感染可導(dǎo)致支氣管哮喘患兒Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡，從而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)加重。

Noth信號通路是T細(xì)胞分化、增殖和活化的重要通路，在多種免疫疾病中發(fā)揮重要作用。在成熟的免疫細(xì)胞表面均有Noth受體的表達(dá)，Notch是一種單次跨膜受體蛋白，通過細(xì)胞間相互作用可活化下游靶基因Hes，影響T細(xì)胞的生理功能，特別是在Th17/Treg細(xì)胞分化中作用最為顯著[19]。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎小鼠Th17細(xì)胞及Th17/Treg明顯升高，同時Notch信號通路蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)[20]。Gurczynski等[21]研究Notch信號通路γ分泌酶抑制劑（GSI）對肺部感染小鼠的炎癥進展發(fā)現(xiàn)，小鼠脾臟Th17/Treg水平趨于平衡，氣道炎癥程度和臨床癥狀明顯減輕。本研究中感染組患兒Notch1 mRNA、Hes1mRNA明顯增高，與該組患兒Th17細(xì)胞占優(yōu)勢相一致。進一步分析顯示，Notch1 mRNA、Hes1mRNA的表達(dá)與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，表明肺部感染可能通過Notch信號通路調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫平衡參與支氣管哮喘的進展。

綜上所述，肺部感染降低支氣管哮喘患兒肺功能，加重全身炎癥程度，其可能的機制是肺部感染通過增強Notch信號通路促進支氣管哮喘患兒Th17、Treg細(xì)胞免疫紊亂。