金素麗，秘玉靜，趙 帥，馬利鋒，沈 莉，閆國超，武 艷△

1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗中心，河北石家莊 050030；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外八科，河北石家莊 050004

膽囊結(jié)石是臨床上常見的一種疾病。目前，尚缺乏全國性膽囊結(jié)石的流行病學(xué)資料。有研究報道，我國膽囊結(jié)石的患病率為2.3%～6.5%[1]，個別地區(qū)的發(fā)病率甚至可達24.0%[2]，且隨著人口年齡的增長和人們生活水平的提高，其發(fā)病率呈上升趨勢。有研究表明，很多因素可以促進膽囊結(jié)石產(chǎn)生，如遺傳因素、環(huán)境、性別、脂質(zhì)代謝異常、膽囊功能、生活習(xí)慣、其他疾病影響等[3-4]，這些危險因素可以通過影響膽汁代謝導(dǎo)致膽汁成分改變或影響膽囊功能而誘發(fā)膽囊結(jié)石[5-6]。雖然目前對膽囊結(jié)石形成的危險因素已有所認識，但仍缺乏預(yù)防膽囊結(jié)石形成的有效策略[7]。膽汁酸是膽囊結(jié)石發(fā)病的重要因子，人體血清中膽汁酸各亞組分的水平變化與膽囊結(jié)石的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，臨床上常用熊脫氧膽酸作為膽囊結(jié)石的治療藥物[1]。因此，膽汁酸的檢測對膽囊結(jié)石的診斷及預(yù)防價值較大。以往由于技術(shù)的限制，臨床上主要測定總膽汁酸水平，不能定量檢測血清中不同膽汁酸代謝組分的變化。隨著超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)的應(yīng)用，膽汁酸代謝譜的檢測在臨床上的應(yīng)用日漸成熟，利用其高通量的特點檢測血清中膽汁酸的亞組分水平及比例，實現(xiàn)疾病的預(yù)防與診斷成為篩選疾病轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的一種新思路。本研究通過對膽囊結(jié)石患者血清膽汁酸譜的檢測，探索膽囊結(jié)石的成石原因，以期為臨床診斷及早期預(yù)防膽囊結(jié)石的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2020年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(下稱本院)確診為膽囊結(jié)石的患者48例作為膽囊結(jié)石組。其中男16 例，女32 例；年齡27～75 歲，平均(54.08±12.68) 歲。納入標(biāo)準：(1)經(jīng)超聲、CT或磁共振胰膽管成像(MRCP)診斷確診為膽囊結(jié)石；(2)同意進行血清膽汁酸譜檢測。排除標(biāo)準： (1)有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝臟損傷的病史；(2)有梗阻性膽管疾病，如結(jié)石、腫瘤等引起的膽管梗阻。48例膽囊結(jié)石患者中，總膽汁酸處于參考范圍內(nèi)患者32例(總膽汁酸正常組)，總膽汁酸高于參考范圍16例。對照組來自同期本院體檢中心經(jīng)彩超確認無膽囊結(jié)石的健康人群26例。其中男10例，女16例；年齡32～76歲，平均(48.35±11.33)歲。膽囊結(jié)石組與對照組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批同意，所有受試者知曉并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器：Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class/Xevo TQD超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司)；H1650R臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；G560E渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；CV100-DNA-H真空離心濃縮儀(北京乾明基因技術(shù)有限公司)；UPLCBEH C18色譜柱(美國Waters公司，100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)。試劑：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)級甲醇、甲酸、乙腈購自美國Fisher Scientific公司；釋放劑及內(nèi)標(biāo)液購自杭州佰辰公司；所有實驗用水均為屈臣氏蒸餾水。

1.3方法

1.3.1樣本的采集及預(yù)處理 (1)樣本采集：膽囊結(jié)石組(術(shù)前)及對照組人員于清晨空腹采集靜脈血5 mL并3 000 r/min 離心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待測。(2)預(yù)處理：取100 μL血清樣本，加入300 μL膽汁酸內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦混合 5 min，12 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，吸取上清液300 μL，低溫濃縮2 h至近干；用100 μL的樣本釋放劑B液復(fù)溶，旋渦混合5 min，12 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液80 μL于96孔板中，采用UPLC-MS/MS對膽汁酸進行分析。

1.3.2UPLC-MS/MS 分析 (1)采用線性梯度洗脫模式對膽汁酸進行色譜分離，流速為0.4 mL/min，柱溫為45 ℃。流動相A為10% (體積比)的甲酸水溶液，動相B為乙腈∶甲醇(3∶1)的混合溶劑。梯度分離條件為：起始38%的流動相B維持0.5 min，至1.9 min升到48% B，第6.7 min 升到64% B，8.7 min 升到83% B，10.7 min 升到95% B，11.3 min降至起始梯度并平衡至12 min。進樣量為5 μL。(2)質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源(ESI)負離子模式進行離子化。采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 模式對膽汁酸譜進行定量檢測。

2 結(jié) 果

15種膽汁酸亞組分[膽酸(CA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、脫氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)、甘氨膽酸(GCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、?；悄懰?TCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)、?；切苊撗跄懰?GUDCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)]中，膽囊結(jié)石組的GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA、TCDCA水平高于對照組(P<0.05)；兩組其余膽汁酸亞組分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。總膽汁酸正常組與對照組比較，總膽汁酸正常組DCA、UDCA比對照組低(P<0.05)，GUDCA、TCA比對照組高(P<0.05)，其余膽汁酸亞組分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組膽汁酸譜的比較[M(P25,P75)，nmol/L]

3 討 論

膽囊結(jié)石是臨床上的一種多見病、常發(fā)病。多數(shù)患者并無明顯癥狀，常于健康體檢或其他疾病檢查時發(fā)現(xiàn)。但是結(jié)石的存在會對膽囊的正常結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，如占位性影響膽囊排空功能、結(jié)石嵌頓引起膽絞痛、結(jié)石反復(fù)摩擦膽囊壁誘發(fā)膽囊炎等[1]。目前膽囊結(jié)石的診斷和治療已相對成熟，但術(shù)后發(fā)生其他疾病的風(fēng)險也增大。有研究表明，膽囊結(jié)石、膽囊切除術(shù)可以增加大腸癌發(fā)生的危險性[8-9]。此外，膽囊結(jié)石術(shù)后結(jié)石復(fù)發(fā)率較高，約為20%[10-11]。因此，對膽囊結(jié)石形成的原因及預(yù)防的研究顯得尤為重要。

膽汁酸是膽固醇的代謝產(chǎn)物，占人體總膽汁的50%～70%。膽汁酸成分的改變是膽囊結(jié)石形成的主要原因之一。在非疾病狀態(tài)下，血清中膽汁酸各亞組分水平及比例基本穩(wěn)定，其中CA約占總膽汁酸的40%，CDCA占40%，DCA占 18%，LCA 不足2%。在疾病狀態(tài)下，受肝細胞功能和膽汁酸肝腸循環(huán)的影響，血清中膽汁酸各亞型的種類及含量可能發(fā)生改變，以致膽固醇不能維持微膠粒狀態(tài)而析出，最終導(dǎo)致結(jié)石的形成。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石組GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA及TCDCA 6種膽汁酸亞組分水平比對照組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。原因可能是由于膽囊結(jié)石患者體內(nèi)結(jié)石大小、數(shù)量或部位不同導(dǎo)致部分患者膽汁淤滯，而使血清中的總膽汁酸升高。為排除膽囊結(jié)石組部分病例由于總膽汁酸升高而導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果的偏差，作者對膽囊結(jié)石組中總膽汁酸處于正常參考范圍內(nèi)的病例與對照組進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總膽汁酸正常組DCA、UDCA水平比對照組低，而GUDCA、TCA比對照組高(P<0.05)。由此推斷，可能由于某種機制的作用，膽囊結(jié)石患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化為DCA、UDCA的膽汁酸減少，而增加了GUDCA、TCA的轉(zhuǎn)化生成，最終導(dǎo)致體內(nèi)膽汁酸亞組分比例發(fā)生變化。

本研究與陳則旭[12]的相關(guān)報道存在異同。其相同之處在于，均發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石組的GUDCA、TCA比對照組升高，UDCA比對照組下降；不同之處在于，陳則旭等[12]研究認為，膽囊結(jié)石組GCA和TCDCA比對照組升高。這可能因為本研究中未排除總膽汁酸升高因素。本研究結(jié)果提示，不論總膽汁酸升高與否，膽囊結(jié)石患者體內(nèi)GUDCA和TCA水平比健康人高。另有研究認為，膽汁酸各亞組分在膽石癥發(fā)生前，即超聲、CT等結(jié)果正常時已有明顯的改變[11]。

綜上所述，GUDCA和TCA可能為膽囊結(jié)石診斷和預(yù)防的重要標(biāo)志物，但限于本研究的樣本量較少，后續(xù)還需要進行大樣本的研究。