邱智軍，陳艷楠，原江鋒, 張 彬

(河南科技大學(xué)a.食品與生物工程學(xué)院；b.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

0 引言

葡萄酒具有令人舒適的特征和性質(zhì)，中國(guó)作為葡萄酒產(chǎn)業(yè)大國(guó)，每一種葡萄酒均具有區(qū)別于其他葡萄酒所獨(dú)有的香氣和口感[1]。葡萄酒的香氣物質(zhì)主要有酯、醇、酸、醛、酮、酚、萜類和其他物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)對(duì)葡萄酒的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[2-4]。目前，越來越多的人開始嘗試自釀葡萄酒，然而對(duì)其品質(zhì)好壞卻無法評(píng)估，因此對(duì)于自釀葡萄酒香氣成分的分析具有重要意義。目前，酒的香氣成分富集方法主要有液-液萃取法(liquid-liquid extraction method，LLE)[5-7]、頂空固相微萃取法(headspace solid phase microextraction method，SPME)[8-10]、水蒸氣蒸餾法(steam distillation extraction method，SDE)和攪拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction method，SBSE)[11]等。目前，對(duì)于果酒和白酒等的香氣成分的研究較多[12]，而對(duì)于自釀紅葡萄酒的香氣成分的研究尚未見報(bào)道。

為了更加全面地分析自釀葡萄酒中香氣成分的種類和含量，本研究采用LLE、SPME和SDE這3種香氣成分提取方法對(duì)自釀葡萄酒進(jìn)行處理，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對(duì)自釀半年和一年半的葡萄酒香氣成分進(jìn)行分析，同時(shí)探討并比較這3種提取方法的萃取效果和特點(diǎn)，為自釀葡萄酒的品質(zhì)以及安全性分析提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄(山西運(yùn)城葡萄生產(chǎn)基地)；果酒酵母(湖北安琪生物集團(tuán)有限公司)；二氯甲烷(CH2Cl2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)，無水乙醇(C2H6O，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)，無水硫酸鈉(Na2SO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)，乙醚(C4H10O，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)等，以上均是分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

6890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó) Agilent)；揮發(fā)油提取器(天津市德固特科技發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；微量移液器(美國(guó)Eppendorf公司)；65 μm聚二甲基硅烷/二乙烯基苯固相微萃取纖維頭及萃取手柄(美國(guó)Supelco公司)。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的釀造

選取成熟的玫瑰香葡萄(可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.7%)，洗凈晾干后除梗、破碎。攪拌均勻后，裝在玻璃瓶中。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的白砂糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的果酒酵母，在15～25 ℃下進(jìn)行前發(fā)酵，期間用已消毒的勺子每天按壓葡萄皮2次防止生霉。發(fā)酵高潮過后，發(fā)酵勢(shì)頭開始減弱直至二氧化碳放出接近平靜，發(fā)酵10 d后，汁液開始清晰時(shí)將葡萄皮和葡萄籽過濾。將濾好的葡萄酒瓶封閉，放在陰涼處保存進(jìn)行二次發(fā)酵，里面的雜質(zhì)會(huì)自動(dòng)沉淀，密閉發(fā)酵20 d后，采用虹吸法除去酵母菌，滿灌密封陳釀半年和一年半后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 液-液萃取法

取30 mL待測(cè)酒樣，分別用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，將有機(jī)相在1 500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min后加入無水硫酸鈉脫水干燥，45 ℃減壓濃縮，4 ℃保存，供GC-MS分析。

1.3.3 水蒸氣蒸餾法

取酒樣30 mL置于揮發(fā)油提取器的蒸餾瓶中，加等體積水后連續(xù)蒸餾5 h。采用乙醚萃取含揮發(fā)油的蒸餾液3 次，含揮發(fā)油的乙醚萃取液用無水硫酸鈉脫水過夜，自然揮發(fā)除去乙醚后得到淡黃色油狀液體，待GC-MS聯(lián)用儀檢測(cè)使用。

1.3.4 頂空固相微萃取法

量取8 mL不同陳釀時(shí)間葡萄酒酒樣置于頂空瓶中，將65 μm聚二甲基硅院/二乙烯基苯固相微萃取頭插入樣品瓶中，萃取30 min后立即拔出萃取器針頭，供GC-MS分析。

1.3.5 GC-MS條件

GC條件：起始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，再以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，流量為1.0 mL/min，載氣為氦氣(He)。

MS條件：電離方式為電子電離，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 u。對(duì)采集到的質(zhì)譜圖利用NIST05譜庫進(jìn)行檢索，并用氣相色譜峰面積歸一化定量計(jì)算出各香氣成分在酒樣中的相對(duì)百分含量(以下簡(jiǎn)稱含量)。相對(duì)百分含量=(每個(gè)組分的峰面積/所有組分的峰面積之和)×100%。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)檢測(cè)條件，對(duì)自釀葡萄酒揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖。采用NIST圖庫檢索，按照檢索匹配度>80%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行待測(cè)組分定性，以峰面積歸一法計(jì)算自釀葡萄酒中揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量，所得結(jié)果見表1。

2.1 不同萃取方法下自釀葡萄酒的香氣物質(zhì)分析

2.1.1 LLE的結(jié)果

通過液-液萃取與GC-MS聯(lián)用對(duì)陳釀半年和陳釀一年半的自釀葡萄酒香氣成分進(jìn)行提取與分析，經(jīng)計(jì)算機(jī)貯存信號(hào)的檢索及質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，確定化合物[13]，并采用峰面積歸一化法測(cè)定各成分相對(duì)百分含量，鑒定出陳釀一年半的葡萄酒中主要香氣成分包括酯類15種、醇類8種、酸類7種，分別占總組分的35.98%、49.18%、2.39%。在陳釀半年的葡萄酒中鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括酯類15種、醇類10種、酸類6種，分別占總組分的18.64%、72.06%、1.54%。

2.1.2 SDE的結(jié)果

通過水蒸氣蒸餾法與GC-MS聯(lián)用對(duì)陳釀一年半和陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分進(jìn)行提取與分析，共鑒定出陳釀一年半葡萄酒中的主要香氣成分有酯類6種、醇類6種，分別占總組分的16.86%、71.85%。陳釀半年葡萄酒中鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括酯類5種、醇類6種，分別占總組分的13.65%、81.62%。采用SDE方法可以富集含量較高的香氣成分。

2.1.3 SPME的結(jié)果

通過SPME與GC-MS聯(lián)用對(duì)陳釀一年半和陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分進(jìn)行提取與分析，并參考文獻(xiàn)[14]用SPME后用GC-MS檢測(cè)出的多種揮發(fā)性成分對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)后，鑒定出主要香氣成分有酯類21種、醇類8種、酸類7種，陳釀一年半的自釀葡萄酒中香氣成分占總組分的57.33%、35.57%、2.68%，陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分占總組分的44.15%、43.97%、3.45%。文獻(xiàn)[15]也應(yīng)用SPME對(duì)4種紅葡萄酒進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，在香氣成分的主要化合物類型組成上與上述結(jié)果十分相似，即酯類和醇類占比80%以上，其他類型化合物占比基本都低于5%。

從鑒定物質(zhì)種類及數(shù)量來看，3種萃取方法中的任何單獨(dú)一種都無法提取到表1中所列的所有化合物。這提示，全面地考察葡萄酒香氣化合物組成可能需要使用多萃取方法聯(lián)合分析。通過比較化合物種類發(fā)現(xiàn)，SDE提取到的化合物全都可以被LLE和SPME中的一種或兩種同時(shí)提取得到，在不考慮提取效率的情況下，LLE和SPME完全可以替代SDE的作用，甚至可以提取到更為豐富的化合物種類。LLE和SPME兩者比較，有31種化合物不能被兩種方法單獨(dú)使用時(shí)同時(shí)提取得到，占所有鑒定到的58種香氣物質(zhì)中的53.45%。這說明LLE和SPME具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性。

3種萃取方法得到的提取物的主體化合物種類是一致的，都是酯類和醇類，兩者之和占比都在85%以上，決定了葡萄酒香氣的主體基調(diào)。酸類、酚類、醛類等非主體化合物在葡萄酒中含量雖少，但它們?cè)跊Q定葡萄酒的品質(zhì)和安全性方面也起著重要的作用。SDE對(duì)于相對(duì)稀有的化合物種類提取效率較低，所以葡萄酒香氣物質(zhì)提取建議采用LLE和SPME聯(lián)合萃取方法，充分利用兩者在提取效果方面的互補(bǔ)作用，從而更全面地評(píng)價(jià)葡萄酒香氣的性質(zhì)。LLE和SPME的互補(bǔ)作用可以由圖1來說明，兩者的提取差異主要在非主體化合物方面。LLE單獨(dú)提取到了酮類和其他類，而SPME單獨(dú)提取到了酚類和萜醇類，所以能夠明顯看出，兩者聯(lián)合使用可以大大提高香氣化合物的提取效率。

(a) 陳釀半年

(b) 陳釀一年半

2.2 葡萄酒香氣的有效成分分析

通過GC-MS分析，從3種提取物中共鑒定出58種香氣物質(zhì)，包括22種酯類、12種醇類、3種醛類、9種酸類、3種酮類、2種萜醇類、1種酚類和6種其他類物質(zhì)，詳細(xì)結(jié)果見表1。由表1可知：陳釀半年酒樣LLE所得提取物中鑒定出40種，SPME所得提取物中鑒定出41種，SDE所得提取物中鑒定出16種；陳釀一年半酒樣LLE所得提取物中鑒定出41種，SPME所得提取物中鑒定出41種，SDE所得提取物中鑒定出17種。從這3種提取方式獲得的物質(zhì)鑒定結(jié)果來看，陳釀半年和陳釀一年半的自釀葡萄酒在香氣成分的種類數(shù)量方面相差并不大。

2.2.1 酯類揮發(fā)性成分

酯類物質(zhì)是葡萄酒中組分最豐富及相對(duì)百分含量較多的重要成分，是使得葡萄酒風(fēng)味濃郁的物質(zhì)基礎(chǔ)，由表1可知：酯類是葡萄酒最重要的香氣組成成分，3種方法下共鑒定出22種酯類物質(zhì)，乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁二酸二乙酯是最主要的酯類物質(zhì)，且酯類物質(zhì)在SPME提取物中鑒定出的種類最多，陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在SPME提取物中鑒定出酯類物質(zhì)21種，相對(duì)百分含量分別為44.15%和57.33%；陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在LLE提取物中鑒定出 15種，相對(duì)百分含量分別為19.06%和35.98%；陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在SDE提取物中分別鑒定出5種和6種，相對(duì)百分含量分別為13.65%和16.86%。就酯類物質(zhì)而言，文獻(xiàn)[16-17]對(duì)紅葡萄酒中的揮發(fā)性成分分析顯示檢測(cè)到最多的香氣物質(zhì)是酯類和醇類。陳釀一年半的自釀葡萄酒的酯類物質(zhì)相對(duì)百分含量要高于陳釀半年的樣品，這可能是因?yàn)槠咸丫频年愥勆甚ヮ惢衔镙^多，并且SPME能萃取到更多的物質(zhì)種類。

自釀葡萄酒檢測(cè)到的乙酸乙酯，在每種提取方法下各樣本中均為相對(duì)百分含量最高的酯類物質(zhì)，是自釀葡萄酒香氣的主要組成物質(zhì)；辛酸乙酯、癸酸乙酯僅在SPME方法檢測(cè)到，并且相對(duì)百分含量較高，這些酯因?yàn)樽陨砭哂械奶厥庀銡?，能夠豐富葡萄酒的酒香。

2.2.2 醇類揮發(fā)性成分

由表1可知：醇類物質(zhì)是自釀葡萄酒的第2種主體香氣物質(zhì)，共有12種醇類物質(zhì)被鑒定出來，其中有11種屬于高級(jí)醇。高級(jí)醇一般會(huì)影響葡萄酒的口感協(xié)調(diào)性，其含量過少使風(fēng)味寡淡，含量過高則增加苦澀感。LLE分離鑒別出醇類物質(zhì)10種；SDE分離鑒別出醇類物質(zhì)6種；SPME分離鑒別出醇類物質(zhì)8種。就醇類物質(zhì)而言，LLE較SPME和SDE能萃取到更多的物質(zhì)種類。

從陳釀一年半的酒樣對(duì)比可以看出，高級(jí)醇在陳釀過程中與有機(jī)酸緩慢酯化產(chǎn)生新物質(zhì)，降低了高級(jí)醇的含量。LLE方法提取到的醇類物質(zhì)種類高于SDE和SPME；3種方法提取到的醇類物質(zhì)種類有所不同，異戊醇、異丁醇、β-苯乙醇和2-甲基-丁醇等高級(jí)醇相對(duì)百分含量較高，在高級(jí)醇的組分中以異戊醇和β-苯乙醇對(duì)葡萄酒的風(fēng)味影響最大[18]，并且陳釀半年酒樣中異戊醇在高級(jí)醇組成中高于陳釀一年半酒樣的相對(duì)百分含量。β-苯乙醇具有玫瑰香氣，有助于葡萄酒具有良好的感官特性，陳釀半年酒樣中β-苯乙醇的含量高于陳釀一年半酒樣的相對(duì)百分含量；另外，2-甲基丁醇和2,3-丁二醇均具有特殊香味，對(duì)葡萄酒風(fēng)味形成也具有重要作用[19]。

2.2.3 萜類揮發(fā)性成分

萜類化合物僅有SPME提取檢測(cè)到兩個(gè)化合物—香茅醇和芳樟醇，兩者均具有花香味。萜類化合物在陳釀半年的自釀葡萄酒中的相對(duì)百分含量要高于陳釀一年半的樣品，由于檢測(cè)結(jié)果中也未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)衍生物，推測(cè)萜類化合物在自釀葡萄酒陳釀的過程中發(fā)生了氧化降解。

2.2.4 醛酮酚類揮發(fā)性成分

醛和酮主要是由酸的脫羧和醇的氧化形成，3種萃取方法下共計(jì)鑒定出醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)各3種。在LLE、SDE和SPME的條件下，陳釀一年半的葡萄酒分離鑒別出的醛類物質(zhì)相對(duì)百分含量分別為0.66%、0.22%和0.37%，陳釀半年的葡萄酒分離鑒別出的醛類物質(zhì)相對(duì)百分含量分別為0.51%、0.14%和0.26%。在LLE和SDE的條件下，陳釀一年半的葡萄酒分離鑒別出的酮類物質(zhì)相對(duì)百分含量分別為0.56%和0.15%，陳釀半年的葡萄酒分離鑒別出的酮類物質(zhì)相對(duì)百分含量分別為0.44%和0.06%。由此可以看出：LLE較SPME和SDE能萃取到更高含量的醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)。酚類物質(zhì)相對(duì)百分含量由陳釀半年時(shí)的5.31%降到陳釀一年半時(shí)的1.29%，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)而下降[20]?？啡┦遣捎貌煌臋z測(cè)方法檢測(cè)到相對(duì)百分含量較高的醛類化合物，陳釀一年半自釀葡萄酒糠醛的相對(duì)百分含量高于陳釀半年糠醛相對(duì)百分含量，其變化可能與貯藏時(shí)間、環(huán)境等因素有關(guān)。一定劑量的糠醛被機(jī)體吸收后，會(huì)對(duì)肝臟、腎臟、心臟等器官產(chǎn)生不良影響[21]，因此自釀葡萄酒在長(zhǎng)時(shí)間陳釀的過程中存在潛在的安全問題。

2.2.5 酸類揮發(fā)性成分

酸類物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒果香香氣的重要組成成分之一，共有9種酸被鑒別出，陳釀一年半的自釀葡萄酒采用LLE和SPME均鑒別出7種，相對(duì)百分含量分別為2.39%和2.68%；陳釀半年的自釀葡萄酒采用LLE和SPME分離鑒別出的相對(duì)百分含量分別為1.54%和3.45%；采用SDE沒有得到酸類成分。由此可以看出：LLE和SPME均能很好地提取到酸類物質(zhì)。己酸和辛酸是紅葡萄酒常見的脂肪酸，在自釀葡萄酒中也檢測(cè)到了這些化合物。通過兩個(gè)不同陳釀時(shí)間自釀葡萄酒的比較發(fā)現(xiàn)，酸類化合物盡管要參與酯類物質(zhì)生成而發(fā)生消耗，但其在香氣物質(zhì)總組成中所占比例并未發(fā)生太大變化；自釀葡萄酒發(fā)酵過程中需定時(shí)攪酒、倒桶、過濾，會(huì)使得乙醇部分揮發(fā)，生成的醋酸相對(duì)百分含量相應(yīng)下降，也促使自釀葡萄酒口感變好。

3 結(jié)論

(1)自釀葡萄酒香氣包含酯、醇、酸、醛、酮、酚、萜類等成分，其中，酯類與醇類物質(zhì)占比較大，這與紅葡萄酒揮發(fā)性成分分析相關(guān)報(bào)道類似。說明自釀葡萄酒中香氣成分種類豐富，具有較好的飲用品質(zhì)。

(2)就富集的自釀葡萄酒香氣成分的種類而言，SDE提取到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最少，而LLE和SPME表現(xiàn)出很強(qiáng)的互補(bǔ)性，通過聯(lián)合這兩種方法對(duì)自釀葡萄酒香氣成分進(jìn)行提取，相較于單一提取方法可以獲得更加全面的物質(zhì)種類，可為自釀葡萄酒的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供更為充足的數(shù)據(jù)支持。

(3)自釀葡萄酒陳釀時(shí)間從半年到一年半，可以發(fā)現(xiàn)香氣成分種類和含量上明顯的差異和變化，其中包括糠醛等有害物質(zhì)相對(duì)百分含量升高，這提示自釀葡萄酒的飲用也需充分考慮適飲期和陳年能力。