鄭惠心，孫嵩，陳玉雯，馮小偉

病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是由多種病毒毒素侵襲腦實(shí)質(zhì)或軟腦膜導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，也是導(dǎo)致兒童神經(jīng)功能受損或死亡的主要因素之一[1]。因此尋找合適的血清指標(biāo)快速準(zhǔn)確地評(píng)估VE的嚴(yán)重程度和預(yù)后對(duì)早期干預(yù)治療至關(guān)重要。T細(xì)胞正常表達(dá)和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)可使多種白細(xì)胞活化，促進(jìn)炎性反應(yīng)；同時(shí)也能夠抑制病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制過程[2]。研究表明[3]，RANTES能夠結(jié)合其特異性受體C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，促進(jìn)T細(xì)胞表面CD34和CD44表達(dá)；同時(shí)增強(qiáng)炎性細(xì)胞與感染組織細(xì)胞的黏附性，從而加速炎性反應(yīng)進(jìn)展。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eosinophil chemoattractant chemokine，Eotaxin)屬于趨化因子C-C 家族成員，其編碼基因位于17q21，在Th1和Th2型細(xì)胞膜表面表達(dá)，能夠參與效應(yīng)T細(xì)胞的活化、分化及遷移，誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞免疫的發(fā)生[4]。研究表明[5]，Eotaxin對(duì)淋巴細(xì)胞、Th2型細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞均具有較強(qiáng)的催化作用，并誘導(dǎo)以上細(xì)胞合成釋放組胺，促進(jìn)肥大細(xì)胞生長，分泌過敏介質(zhì)，從而調(diào)節(jié)速發(fā)型過敏性炎性反應(yīng)。

目前，RANTES和Eotaxin在VE中研究罕見，且對(duì)其嚴(yán)重程度及預(yù)后的影響尚不清楚。因此，現(xiàn)觀察VE患兒血清中RANTES和Eotaxin的表達(dá)，并分析其與VE嚴(yán)重程度的關(guān)系及對(duì)預(yù)后不良的診斷效能，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月—2020年5月海南省人民醫(yī)院兒科收治VE患兒101例作為VE組，同時(shí)選取醫(yī)院同齡體檢健康兒童97例作為健康對(duì)照組。VE組男60例，女41例，年齡2～11(7.05±1.81)歲；重癥45例(表現(xiàn)為驚厥、昏迷及定向力障礙)，輕癥56例(表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、腹瀉等非特異性癥狀)。健康對(duì)照組男55例，女42例，年齡3～10(7.11±1.72)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2017-007)，受試兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《神經(jīng)病學(xué)》[6]中對(duì)VE的診斷標(biāo)準(zhǔn)及嚴(yán)重程度評(píng)估；②VE病程均<7 d，且既往未經(jīng)治療；③既往3個(gè)月內(nèi)無外科手術(shù)史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性免疫系統(tǒng)缺陷者；②伴有肺炎、腎炎等其他部位急性感染者；③合并腦膿腫、結(jié)核性腦膜炎者；④2周內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素或抗生素藥物者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清RANTES、Eotaxin水平檢測：VE患兒于入院當(dāng)日、健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血10 ml置于抗凝管中，離心收集上層清液，將其置于-80℃冰箱中保存。通過酶聯(lián)免疫法檢測血清RANTES、Eotaxin水平。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測：上述血清采用全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司，型號(hào)COBAS INTEGRA 800)檢測血清白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、肌酸激酶腦型同工酶(CK-BB)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)。

1.4 預(yù)后評(píng)估 通過電話或門診進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)間為3個(gè)月或VE患兒死亡截止。采用格拉斯哥預(yù)后量表(Glasgow outcome scale，GOS)[7]評(píng)估VE患兒預(yù)后。死亡為1分；植物人生存狀態(tài)為2分；重度殘疾，日常生活不能自理為3分；輕度殘疾，但是可以獨(dú)立生活為4分；恢復(fù)良好，正常生活為5分。其中1～3分為預(yù)后不良，4～5分為預(yù)后良好。

2 結(jié) 果

2.1 2組受試者血清RANTES、Eotaxin比較 VE組血清RANTES、Eotaxin水平均高于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表1。

表1 健康對(duì)照組及VE組血清RANTES、Eotaxin水平比較

2.2 不同病情VE患兒臨床資料比較 不同病情VE患兒性別、年齡、WBC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，重癥VE患兒血清CK-BB、NSE、MBP及RANTES、Eotaxin均高于輕癥患兒(P均<0.01),見表2。

表2 不同病情嚴(yán)重程度VE患兒臨床資料比較

2.3 血清RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與CK-BB、NSE及MBP均呈正相關(guān)(P均<0.01)，見表3。

表3 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 影響重癥VE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析 二元Logistic多因素回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見表4。

表4 二元Logistic回歸模型分析重癥VE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

2.5 血清RANTES、Eotaxin水平對(duì)VE患兒預(yù)后不良的診斷價(jià)值 以VE患兒是否發(fā)生預(yù)后不良為因變量，以上述2項(xiàng)指標(biāo)為自變量，繪制ROC曲線。血清RANTES、Eotaxin的最佳截?cái)嘀捣謩e為300 ng/L、183.5 ng/L，AUC分別為0.784、0.761，二者聯(lián)合的AUC為0.863，優(yōu)于單一指標(biāo)預(yù)測VE患兒發(fā)生預(yù)后不良的效能(Z=6.233、5.490，P均<0.001)，見圖1、表5。

表5 血清RANTES、Eotaxin水平對(duì)預(yù)后不良VE患兒的診斷價(jià)值

圖1 血清RANTES、Eotaxin水平對(duì)VE患兒預(yù)后不良的診斷價(jià)值

3 討 論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國是VE的高發(fā)國家，其年均發(fā)病率為3.5/10萬～7.4/10萬，以夏秋季為主，存在一定的區(qū)域性及病原譜差異。VE在初期癥狀較隱匿，疾病進(jìn)展迅速，且臨床癥狀多樣，易導(dǎo)致多種臟器功能障礙，致殘率較高。VE的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，涉及體液免疫、細(xì)胞免疫、炎性因子、細(xì)胞因子等多種因素之間的相互作用[1]。目前，針對(duì)VE嚴(yán)重程度和預(yù)后的評(píng)估主要以臨床癥狀、腦電圖及腦脊液檢查為主，耗時(shí)長，具有一定的誤差性。因此，發(fā)現(xiàn)合適的生化指標(biāo)對(duì)VE的病情評(píng)估及預(yù)后分析具有重要價(jià)值。

RANTES是一種長鏈糖蛋白，其編碼基因位于17q11.2上，結(jié)構(gòu)呈高度保守性，在多種細(xì)胞中均能轉(zhuǎn)錄合成，能夠誘導(dǎo)多種炎性因子和細(xì)胞活化，促進(jìn)局部免疫損傷[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[2]，RANTES能夠誘導(dǎo)特異性的CD8+T細(xì)胞合成，并定向趨化移動(dòng)至流感病毒侵襲組織處，促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生。Ajamian等[3]發(fā)現(xiàn)，RANTES能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞分化，并使其遷移至支氣管肺泡灌洗液及上呼吸道內(nèi)，加重哮喘的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，VE組血清RANTES水平較健康兒童高，提示RANTES可能在VE發(fā)病時(shí)具有一定作用。其原因可能是病毒毒素透過血腦屏障時(shí)刺激抗原遞呈細(xì)胞，經(jīng)其遞呈至巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞活化，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌大量的RANTES，并釋放入血，使血清中RANTES水平升高[8]。且本研究結(jié)果表明，血清RANTES隨患兒病情的加重而升高，提示RANTES可能參與調(diào)控VE的進(jìn)展，與Kalita等[8]的研究結(jié)果相符。其原因可能是RANTES能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，使其磷酸化并遷移至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nclear factor-kB，NF-κB)活化，促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)展，加重腦組織的損傷程度[9]。Dao等[10]發(fā)現(xiàn)，RANTES能夠促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，并誘導(dǎo)其與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of Transcription, STAT)結(jié)合，使STAT發(fā)生二聚體化，釋放γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，增強(qiáng)炎性反應(yīng)的程度。

Eotaxin是一種β趨化因子，由72個(gè)氨基酸殘基組成，由巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)合成分泌，與人膜輔助蛋白具有高度同源性，對(duì)EOS具有選擇性化學(xué)趨化作用[11]。Eotaxin通過結(jié)合其特異性受體趨化因子受體3(chemokine receptor 3，CCR3)，促進(jìn)干細(xì)胞分化成EOS，以滾動(dòng)、黏附及滲出的方式向外周循環(huán)遷移，并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，在病毒或病菌累及的組織中大量聚集，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[12]。Molina-Infante等[4]發(fā)現(xiàn)，CCR3拮抗劑使EOS的趨化、募集受阻，遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的程度減輕，同時(shí)分化成EOS的比例也呈下降趨勢。本研究結(jié)果表明，VE患兒血清Eotaxin水平高于健康兒童，提示Eotaxin可能參與調(diào)控VE的發(fā)病過程，這與Cui等[5]的研究結(jié)果一致。其原因可能是病毒入侵腦實(shí)質(zhì)后單核細(xì)胞活化，經(jīng)過信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，使Eotaxin mRNA的啟動(dòng)子活化，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄翻譯過程，合成Eotaxin并釋放入血，提高血清中Eotaxin水平[13]。同時(shí)，重癥VE患兒血清Eotaxin水平高于輕癥患兒，提示Eotaxin可能在VE的進(jìn)展過程中發(fā)揮一定作用。其原因可能是Eotaxin能夠激活CCR3，促進(jìn)EOS浸潤感染組織，誘導(dǎo)EOS發(fā)生脫顆粒作用，合成并釋放大量的蛋白酶、炎性介質(zhì)及內(nèi)源性刺激物，損傷腦實(shí)質(zhì)，加重VE的嚴(yán)重程度[12,14]。此外，Eotaxin能夠促進(jìn)硝基酪氨酸及一氧化氮合酶合成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放活性氧，使腦膜和腦組織發(fā)生局部氧化損傷，導(dǎo)致病情加重[5,14]。

二元Logistic回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，提示血清中RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP水平高低是影響VE嚴(yán)重程度的重要因素，這對(duì)評(píng)估重癥VE患兒具有重要幫助。Pearson相關(guān)分析顯示，VE患兒血清中RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷指標(biāo)存在相關(guān)性，可能對(duì)輔助判斷神經(jīng)損傷情況具有一定幫助。其原因是RANTES能夠結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)血腦屏障趨化運(yùn)動(dòng)至病毒侵襲的腦實(shí)質(zhì)處，釋放大量的炎性因子，破壞腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)纖維細(xì)胞，使腦神經(jīng)功能受損[15-16]。Eotaxin-CCR3軸能夠激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2和分裂素活化蛋白激酶，誘導(dǎo)白介素13大量釋放聚集，使神經(jīng)細(xì)胞變性或凋亡，同時(shí)，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，增強(qiáng)肥大細(xì)胞對(duì)腦組織的黏附性及反應(yīng)性，使肥大細(xì)胞產(chǎn)生的組胺及炎性因子直接損傷腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)纖維細(xì)胞，加重腦神經(jīng)功能損傷程度[17-18]。ROC曲線顯示，血清RANTES聯(lián)合Eotaxin能夠提高VE患兒發(fā)生預(yù)后不良的診斷價(jià)值。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，RANTES聯(lián)合Eotaxin的敏感度和特異度均較高，彌補(bǔ)了單一指標(biāo)敏感度或特異度不高的缺陷，提示2指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)早期評(píng)估VE患兒發(fā)生預(yù)后不良具有較高預(yù)測價(jià)值。

總之，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin均升高，且是重癥VE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)，血清中RANTES和Eotaxin水平能夠在一定程度上反映神經(jīng)功能受損程度。血清RANTES聯(lián)合Eotaxin對(duì)VE患兒發(fā)生預(yù)后不良具有良好的診斷效能，且診斷的真實(shí)性可靠，為臨床實(shí)施進(jìn)一步治療提供有利支持。但由于試驗(yàn)設(shè)備及試驗(yàn)條件有限，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要在接下來的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中逐步證實(shí)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

鄭惠心：提出研究方向、研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，論文撰寫；孫嵩：提出研究思路，數(shù)據(jù)收集，分析整理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳玉雯：實(shí)施研究過程，參與文獻(xiàn)調(diào)研與整理；馮小偉：設(shè)計(jì)研究方案，參與實(shí)施研究過程，論文修改