鄭惠心，孫嵩，陳玉雯，馮小偉

病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是由多種病毒毒素侵襲腦實質(zhì)或軟腦膜導致的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，也是導致兒童神經(jīng)功能受損或死亡的主要因素之一[1]。因此尋找合適的血清指標快速準確地評估VE的嚴重程度和預后對早期干預治療至關重要。T細胞正常表達和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)可使多種白細胞活化，促進炎性反應；同時也能夠抑制病毒在機體內(nèi)的復制過程[2]。研究表明[3]，RANTES能夠結合其特異性受體C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，促進T細胞表面CD34和CD44表達；同時增強炎性細胞與感染組織細胞的黏附性，從而加速炎性反應進展。嗜酸性粒細胞趨化因子(eosinophil chemoattractant chemokine，Eotaxin)屬于趨化因子C-C 家族成員，其編碼基因位于17q21，在Th1和Th2型細胞膜表面表達，能夠參與效應T細胞的活化、分化及遷移，誘導并促進細胞免疫的發(fā)生[4]。研究表明[5]，Eotaxin對淋巴細胞、Th2型細胞及嗜堿性粒細胞均具有較強的催化作用，并誘導以上細胞合成釋放組胺，促進肥大細胞生長，分泌過敏介質(zhì)，從而調(diào)節(jié)速發(fā)型過敏性炎性反應。

目前，RANTES和Eotaxin在VE中研究罕見，且對其嚴重程度及預后的影響尚不清楚。因此，現(xiàn)觀察VE患兒血清中RANTES和Eotaxin的表達，并分析其與VE嚴重程度的關系及對預后不良的診斷效能，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月—2020年5月海南省人民醫(yī)院兒科收治VE患兒101例作為VE組，同時選取醫(yī)院同齡體檢健康兒童97例作為健康對照組。VE組男60例，女41例，年齡2～11(7.05±1.81)歲；重癥45例(表現(xiàn)為驚厥、昏迷及定向力障礙)，輕癥56例(表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、腹瀉等非特異性癥狀)。健康對照組男55例，女42例，年齡3～10(7.11±1.72)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(2017-007)，受試兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合《神經(jīng)病學》[6]中對VE的診斷標準及嚴重程度評估；②VE病程均<7 d，且既往未經(jīng)治療；③既往3個月內(nèi)無外科手術史。(2)排除標準：①先天性免疫系統(tǒng)缺陷者；②伴有肺炎、腎炎等其他部位急性感染者；③合并腦膿腫、結核性腦膜炎者；④2周內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素或抗生素藥物者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清RANTES、Eotaxin水平檢測：VE患兒于入院當日、健康對照組于體檢當日空腹狀態(tài)下采集靜脈血10 ml置于抗凝管中，離心收集上層清液，將其置于-80℃冰箱中保存。通過酶聯(lián)免疫法檢測血清RANTES、Eotaxin水平。

1.3.2 實驗室相關指標檢測：上述血清采用全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司，型號COBAS INTEGRA 800)檢測血清白細胞(WBC)計數(shù)、肌酸激酶腦型同工酶(CK-BB)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)。

1.4 預后評估 通過電話或門診進行隨訪。隨訪時間為3個月或VE患兒死亡截止。采用格拉斯哥預后量表(Glasgow outcome scale，GOS)[7]評估VE患兒預后。死亡為1分；植物人生存狀態(tài)為2分；重度殘疾，日常生活不能自理為3分；輕度殘疾，但是可以獨立生活為4分；恢復良好，正常生活為5分。其中1～3分為預后不良，4～5分為預后良好。

2 結 果

2.1 2組受試者血清RANTES、Eotaxin比較 VE組血清RANTES、Eotaxin水平均高于健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 健康對照組及VE組血清RANTES、Eotaxin水平比較

2.2 不同病情VE患兒臨床資料比較 不同病情VE患兒性別、年齡、WBC比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，重癥VE患兒血清CK-BB、NSE、MBP及RANTES、Eotaxin均高于輕癥患兒(P均<0.01),見表2。

表2 不同病情嚴重程度VE患兒臨床資料比較

2.3 血清RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷相關指標的相關性 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與CK-BB、NSE及MBP均呈正相關(P均<0.01)，見表3。

表3 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷相關指標的相關性

2.4 影響重癥VE的獨立危險因素分析 二元Logistic多因素回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨立危險因素(P均<0.05)，見表4。

表4 二元Logistic回歸模型分析重癥VE的獨立危險因素

2.5 血清RANTES、Eotaxin水平對VE患兒預后不良的診斷價值 以VE患兒是否發(fā)生預后不良為因變量，以上述2項指標為自變量，繪制ROC曲線。血清RANTES、Eotaxin的最佳截斷值分別為300 ng/L、183.5 ng/L，AUC分別為0.784、0.761，二者聯(lián)合的AUC為0.863，優(yōu)于單一指標預測VE患兒發(fā)生預后不良的效能(Z=6.233、5.490，P均<0.001)，見圖1、表5。

表5 血清RANTES、Eotaxin水平對預后不良VE患兒的診斷價值

圖1 血清RANTES、Eotaxin水平對VE患兒預后不良的診斷價值

3 討 論

據(jù)流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國是VE的高發(fā)國家，其年均發(fā)病率為3.5/10萬～7.4/10萬，以夏秋季為主，存在一定的區(qū)域性及病原譜差異。VE在初期癥狀較隱匿，疾病進展迅速，且臨床癥狀多樣，易導致多種臟器功能障礙，致殘率較高。VE的發(fā)病機制較復雜，涉及體液免疫、細胞免疫、炎性因子、細胞因子等多種因素之間的相互作用[1]。目前，針對VE嚴重程度和預后的評估主要以臨床癥狀、腦電圖及腦脊液檢查為主，耗時長，具有一定的誤差性。因此，發(fā)現(xiàn)合適的生化指標對VE的病情評估及預后分析具有重要價值。

RANTES是一種長鏈糖蛋白，其編碼基因位于17q11.2上，結構呈高度保守性，在多種細胞中均能轉(zhuǎn)錄合成，能夠誘導多種炎性因子和細胞活化，促進局部免疫損傷[2]。動物實驗表明[2]，RANTES能夠誘導特異性的CD8+T細胞合成，并定向趨化移動至流感病毒侵襲組織處，促進特異性免疫反應的發(fā)生。Ajamian等[3]發(fā)現(xiàn)，RANTES能夠促進嗜酸性粒細胞分化，并使其遷移至支氣管肺泡灌洗液及上呼吸道內(nèi)，加重哮喘的嚴重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，VE組血清RANTES水平較健康兒童高，提示RANTES可能在VE發(fā)病時具有一定作用。其原因可能是病毒毒素透過血腦屏障時刺激抗原遞呈細胞，經(jīng)其遞呈至巨噬細胞，使巨噬細胞活化，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌大量的RANTES，并釋放入血，使血清中RANTES水平升高[8]。且本研究結果表明，血清RANTES隨患兒病情的加重而升高，提示RANTES可能參與調(diào)控VE的進展，與Kalita等[8]的研究結果相符。其原因可能是RANTES能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，使其磷酸化并遷移至細胞核內(nèi)，促進核轉(zhuǎn)錄因子κB(nclear factor-kB，NF-κB)活化，促進炎性反應進展，加重腦組織的損傷程度[9]。Dao等[10]發(fā)現(xiàn)，RANTES能夠促進細胞因子分泌，并誘導其與信號傳導及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of Transcription, STAT)結合，使STAT發(fā)生二聚體化，釋放γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，增強炎性反應的程度。

Eotaxin是一種β趨化因子，由72個氨基酸殘基組成，由巨噬細胞和嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)合成分泌，與人膜輔助蛋白具有高度同源性，對EOS具有選擇性化學趨化作用[11]。Eotaxin通過結合其特異性受體趨化因子受體3(chemokine receptor 3，CCR3)，促進干細胞分化成EOS，以滾動、黏附及滲出的方式向外周循環(huán)遷移，并作用于內(nèi)皮細胞，在病毒或病菌累及的組織中大量聚集，發(fā)揮相應的生物學效應[12]。Molina-Infante等[4]發(fā)現(xiàn)，CCR3拮抗劑使EOS的趨化、募集受阻，遲發(fā)性變態(tài)反應的程度減輕，同時分化成EOS的比例也呈下降趨勢。本研究結果表明，VE患兒血清Eotaxin水平高于健康兒童，提示Eotaxin可能參與調(diào)控VE的發(fā)病過程，這與Cui等[5]的研究結果一致。其原因可能是病毒入侵腦實質(zhì)后單核細胞活化，經(jīng)過信號通路轉(zhuǎn)導激活NF-κB，使Eotaxin mRNA的啟動子活化，啟動轉(zhuǎn)錄翻譯過程，合成Eotaxin并釋放入血，提高血清中Eotaxin水平[13]。同時，重癥VE患兒血清Eotaxin水平高于輕癥患兒，提示Eotaxin可能在VE的進展過程中發(fā)揮一定作用。其原因可能是Eotaxin能夠激活CCR3，促進EOS浸潤感染組織，誘導EOS發(fā)生脫顆粒作用，合成并釋放大量的蛋白酶、炎性介質(zhì)及內(nèi)源性刺激物，損傷腦實質(zhì)，加重VE的嚴重程度[12,14]。此外，Eotaxin能夠促進硝基酪氨酸及一氧化氮合酶合成，誘導氧化應激反應，釋放活性氧，使腦膜和腦組織發(fā)生局部氧化損傷，導致病情加重[5,14]。

二元Logistic回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨立危險因素(P均<0.05)，提示血清中RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP水平高低是影響VE嚴重程度的重要因素，這對評估重癥VE患兒具有重要幫助。Pearson相關分析顯示，VE患兒血清中RANTES、Eotaxin水平與神經(jīng)損傷指標存在相關性，可能對輔助判斷神經(jīng)損傷情況具有一定幫助。其原因是RANTES能夠結合細胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，誘導肥大細胞和單核細胞經(jīng)血腦屏障趨化運動至病毒侵襲的腦實質(zhì)處，釋放大量的炎性因子，破壞腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞，損傷腦實質(zhì)細胞及神經(jīng)纖維細胞，使腦神經(jīng)功能受損[15-16]。Eotaxin-CCR3軸能夠激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2和分裂素活化蛋白激酶，誘導白介素13大量釋放聚集，使神經(jīng)細胞變性或凋亡，同時，促進Ca2+內(nèi)流，增強肥大細胞對腦組織的黏附性及反應性，使肥大細胞產(chǎn)生的組胺及炎性因子直接損傷腦實質(zhì)細胞及神經(jīng)纖維細胞，加重腦神經(jīng)功能損傷程度[17-18]。ROC曲線顯示，血清RANTES聯(lián)合Eotaxin能夠提高VE患兒發(fā)生預后不良的診斷價值。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，RANTES聯(lián)合Eotaxin的敏感度和特異度均較高，彌補了單一指標敏感度或特異度不高的缺陷，提示2指標聯(lián)合應用對早期評估VE患兒發(fā)生預后不良具有較高預測價值。

總之，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin均升高，且是重癥VE的獨立危險因素。同時，血清中RANTES和Eotaxin水平能夠在一定程度上反映神經(jīng)功能受損程度。血清RANTES聯(lián)合Eotaxin對VE患兒發(fā)生預后不良具有良好的診斷效能，且診斷的真實性可靠，為臨床實施進一步治療提供有利支持。但由于試驗設備及試驗條件有限，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin變化的具體機制尚不清楚，需要在接下來的基礎實驗中逐步證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

鄭惠心：提出研究方向、研究思路，設計研究方案，論文撰寫；孫嵩：提出研究思路，數(shù)據(jù)收集，分析整理，進行統(tǒng)計學分析；陳玉雯：實施研究過程，參與文獻調(diào)研與整理；馮小偉：設計研究方案，參與實施研究過程，論文修改