趙永梅，穆葉舒，洪 琛，羅 穩(wěn)，田智勇

（1.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院制藥工程學(xué)院,開封475004；2.河南大學(xué)藥學(xué)院,3.天然藥物與免疫工程重點實驗室,4.淮河醫(yī)院,開封475004）

硝基芳烴類炸藥對公共安全、人類健康和自然環(huán)境的危害極大，對此類爆炸物的檢測十分重要［1］.在硝基芳烴類炸藥中，2，4，6-三硝基甲苯（TNT）和2，4，6-三硝基苯酚（TNP）的應(yīng)用最廣泛，包括炸藥、煙花、火柴、制藥和染料等領(lǐng)域［2］.TNT和TNP的廣泛使用導(dǎo)致其在自然界中殘留量較大，不可避免地對人類和環(huán)境造成危害.尤其是TNP（又稱苦味酸），其在水中的溶解度比TNT高，更容易被人體和動物吸收，從而引起嚴(yán)重的疾?。?］.然而，與其它炸藥相比，人們對TNP的關(guān)注較少.因此，有必要開發(fā)一種快速、靈敏、便捷的方法來檢測TNP，特別是檢測水相中的TNP.

迄今，已經(jīng)有一些文獻(xiàn)報道了可用于檢測TNP的材料，包括石墨相氮化碳［4，5］、碳量子點［6~8］、聚合物［9~12］和金屬有機(jī)框架等［13~17］.然而這些材料大多性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界中不易降解，會對環(huán)境和生物體產(chǎn)生蓄積毒性，因此其應(yīng)用存在一定限制.相比之下，有機(jī)熒光納米粒子（FONs）因其反應(yīng)靈敏、制備簡單和低成本的優(yōu)點而備受關(guān)注，特別是有機(jī)分子與生物體具有良好的相容性，更容易被降解，減少了蓄積毒性，更具有應(yīng)用潛力［18，19］.近年來，關(guān)于利用FONs檢測TNP的研究已經(jīng)取得了一些良好的結(jié)果，但將FONs用于檢測水相中的TNP仍然面臨挑戰(zhàn)［20］.

傳統(tǒng)的有機(jī)熒光小分子在水溶液中容易發(fā)生“聚集引起的猝滅”（ACQ）［21］.而唐本忠院士發(fā)現(xiàn)的一些在聚集態(tài)有強(qiáng)熒光的“聚集誘導(dǎo)發(fā)射”（AIE）或“聚集誘導(dǎo)增強(qiáng)發(fā)射”（AIEE）［22］小分子，為在水相中進(jìn)行熒光檢測提供了可能.

萘酰亞胺類化合物具有良好的熒光性質(zhì)和生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物、化學(xué)和材料等領(lǐng)域［23~26］.例如安奈菲特、米托萘胺和依利奈法德［圖1（A）~（C）］都曾進(jìn)入臨床用于腫瘤治療，其中安奈菲特近期再次進(jìn)入III期臨床試驗用于治療繼發(fā)性急性髓細(xì)胞白血?。?7］.本課題組曾報道了一些具有靶向亞細(xì)胞器和抗腫瘤活性的新型萘酰亞胺衍生物［圖1（D）~（E）］［28，29］，在后續(xù)評價時發(fā)現(xiàn)部分化合物顯示出了AIEE效應(yīng).本文報道了一種新的雙萘酰亞胺衍生物Bis-Nph［圖1（F）］用于水相中TNP的檢測.Bis-Nph是受體（A）-供體（D）-受體（A）型分子，其中受體為1，8-萘酰亞胺單元，供體由苯環(huán)單元組成，其發(fā)射歸因于1，8-萘酰亞胺單元到苯環(huán)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）.TNP可以使Bis-Nph質(zhì)子化，導(dǎo)致其與TNP陰離子之間發(fā)生強(qiáng)的靜電相互作用，從而阻礙ICT效應(yīng)，導(dǎo)致熒光猝滅.Bis-Nph的合成路線如Scheme 1所示.

Fig.1 Chemical structures of Amonafide(A),Mitonafide(B),Elinafide(C),our previous compounds(D,E)and Bis?Nph(F)

Scheme 1 Synthetic route of Bis?Nph

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硅膠（200~300目）購自青島海洋硅膠廠；1-Boc-4-（氨基甲基）哌啶（純度97%）和1，4-二（溴甲基）苯（純度97%）購自上海阿拉丁試劑公司；TNT的甲醇溶液（1.00 mg/mL）和DNT的甲醇溶液（1.00 mg/mL）購自麥克林試劑公司；TNP的乙腈溶液（100μg/mL）購自德國DRE公司；其它試劑均為市售分析純，未做進(jìn)一步處理.

DPX-300型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（1H NMR，13C NMR，瑞士Bruker公司），以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)；Esquire3000型質(zhì)譜儀［MS，電噴霧模式（ESI），美國Bruker公司］；1260-6230型高精度飛行時間質(zhì)譜儀（HRMS，ESI，美國安捷倫公司）；LC-20AB型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）；FS5型熒光光譜儀（PL，英國愛丁堡公司）；X-6型顯微熔點儀（溫度未校正）（上海精密儀器公司）；WFH2204B型手提式紫外燈（UV，上海精科儀器公司）.

1.2 化合物的合成

1.2.1 中間體2的合成 將萘二甲酸酐（1，2.0 mmol）與1-叔丁氧羰基-4-氨甲基哌啶（0.43 g，2.0 mmol）加入到30 mL無水乙醇中，于80℃加熱回流5 h；冷卻至室溫，蒸干溶劑；向殘余物中加入50 mL氯仿，用2 mol/L的稀鹽酸洗滌3次，每次30 mL；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到0.67 g白色固體2，產(chǎn)率85%.

1.2.2 中間體3的合成 將中間體2（2.0 mmol）加入到10 mL無水乙醇中，冰浴下加入5 mL 4 mol/L的鹽酸乙醇溶液（V濃鹽酸∶V乙醇=1∶2），攪拌1 h后撤去冰浴，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌12 h.反應(yīng)完畢減壓蒸除溶劑，硅膠柱層析（V二氯甲烷∶V甲醇=50∶1）得0.48 g白色固體3，產(chǎn)率82%.1H NMR（300 MHz，D2O），δ：7.67（s，2H），7.64（s，2H），7.22（t，J=7.8 Hz，2H），3.55（d，J=6.6 Hz，2H），3.39（d，J=12.9 Hz，2H），2.90（t，J=12.6 Hz，2H），1.89~1.74（m，3H），1.51~1.38（m，2H）.HRMS，m/zcalcd.for C18H18N2O2［M＋H］+：295.1447；found：295.1461.

1.2.3 化合物Bis-Nph的合成 將中間體3（2.1 mmol）、1，4-二（溴甲基）苯（1.0 mmol）和無水碳酸鉀（4.0 mmol）加入到30 mL乙腈中，于60℃攪拌反應(yīng)6 h.反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙腈洗滌3次.合并濾液，濃縮，剩余物用硅膠柱層析（V二氯甲烷∶V甲醇=30∶1）分離，得1.02 g白色固體，收率74%.m.p.：244.5~246.2℃.1H NMR（300 MHz，CDCl3），δ：8.59（d，J=7.2 Hz，4H），8.22（d，J=8.1 Hz，4H），7.76（t，J=7.8 Hz，4H），7.26（s，4H），4.14（d，J=6.9 Hz，4H），3.51（s，4H），2.91（d，J=11.1 Hz，4H），2.08~1.88（m，6H），1.71（d，J=11.4 Hz，4H），1.62~1.50（m，4H）.13C NMR（75 MHz，CDCl3），δ：164.46，133.88，131.57，131.29，129.12，128.18，126.94，122.63，62.79，53.19，45.27，35.04，29.98.MS（ESI），m/z：691.25［M+H］+.HRMS（ESI），m/zcalcd.for C44H42N4O4：691.3284；found：691.3287［M+H］+；purity：95.7%（HPLC）.

1.3 紫外和熒光光譜測試

向一系列測試管中加入適量Bis-Nph儲備液（用DMSO溶解，10 mmol/L）和一定體積的檢測物儲備液（用超純水或DMSO溶解，10 mmol/L），用超純水和THF（體積比7∶3）的混合溶液稀釋，搖勻后放置15 min.將樣品液加入到石英比色皿中，記錄紫外-可見吸收光譜和熒光光譜.

1.4 試紙制備和檢測

將普通定性濾紙用20μmol/L的Bis-Nph溶液（V水∶VTHF=9∶1）浸泡3 h，取出后真空干燥，用玻璃板壓平備用.將市售TNP的THF溶液置于燒杯中揮發(fā)至干，將燒杯底部粉末按壓在試紙上，在紫外燈下（365 nm）觀察并拍照.另取TNP溶液，蒸干后加入少量自來水溶解，稀釋到待測濃度備用，用直徑0.3 mm的薄層層析（TLC）點樣毛細(xì)管輕輕沾取樣品，迅速點至試紙上，吹干后在紫外燈下觀察拍照.

1.5 細(xì)胞毒性測試

采用噻唑藍(lán)（MTT）法測試化合物對細(xì)胞存活率的影響.取對數(shù)生長周期的細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103cell/mL加入到96孔板中，隨后在培養(yǎng)板中加入不同濃度的化合物，每個濃度4個復(fù)孔，在37℃，含5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)48 h.然后，每孔加入50μL MTT溶液（1 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h.除去上清液后，加入100μL DMSO在室溫下溶解晶體產(chǎn)物15 min.用酶標(biāo)儀測試570 nm處的吸光度.根據(jù)抑制率＝（A對照－A樣品）/（A對照－A空白）×100%計算不同濃度下的抑制率，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

以1，8-二萘甲酸酐和1-叔丁氧羰基-4-氨甲基哌啶為起始原料，在無水乙醇中加熱回流生成中間體2，蒸干萃取后可直接用于下一步反應(yīng).中間體2經(jīng)稀鹽酸脫保護(hù)生成鹽酸鹽3，快速柱層析后可得到純品，產(chǎn)率較高.鹽酸鹽3與1，4-二（溴甲基）苯在堿的作用下發(fā)生親核取代反應(yīng)，化學(xué)計量比應(yīng)略大于2∶1，這樣可以避免單取代產(chǎn)物的生成.所得目標(biāo)產(chǎn)物Bis-Nph為新化合物，未見文獻(xiàn)報道.其結(jié)構(gòu)通過1H NMR、13C NMR及HRMS確證，純度通過HPLC測定.

2.2 光譜學(xué)性質(zhì)

萘酰亞胺類具有強(qiáng)熒光發(fā)射，常作為報告基團(tuán)用于檢測金屬離子和生物分子等.通過測試Bis-Nph的吸收光譜和發(fā)射光譜可以看出，室溫下Bis-Nph在不同溶劑中的吸收帶均位于340 nm附近，在純水中的紫外吸收紅移且變寬，表明發(fā)生電子躍遷需要的能量減小，是分子間距變小、共軛程度增加造成的［圖2（A）］.Bis-Nph的熒光發(fā)射隨著溶劑極性的增加而明顯增強(qiáng)［圖2（B）］，是典型的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng).由于酰胺基團(tuán)的吸電子作用，Bis-Nph在THF和CHCl3中的最大發(fā)射波長較短（380 nm），隨著溶劑極性的增加，最大發(fā)射波長發(fā)生了紅移（395 nm）.另外，水相中Bis-Nph分子可能發(fā)生了構(gòu)象轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致萘酰亞胺單體發(fā)射（~395 nm）轉(zhuǎn)換為激基締合物發(fā)射（~495 nm）［圖2（B）］［30］.肉眼可見Bis-Nph在純水中發(fā)出藍(lán)色熒光，亮度明顯強(qiáng)于在其它有機(jī)溶劑中的（圖S1，見本文支持信息）.在石油醚（PE）、四氫呋喃（THF）、氯仿、乙腈、乙醇、水中Bis-Nph的熒光量子產(chǎn)率分別為0.01%，0.02%，0.03%，0.03%，0.03%和0.26%（以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)，Φf=0.55%）.

Fig.2 UV(A)and FL(B,λex=330 nm,slit:2.0/0.5 nm)spectra of Bis?Nph(20μmol/L)in different solvents

由于Bis-Nph在THF中的熒光較弱，通過向Bis-Nph的THF溶液中加入不同比例的水來評價Bis-Nph的AIEE性質(zhì).從圖3（A）可以看出，隨著水的體積分?jǐn)?shù)（fw）增加，化合物的紫外吸收逐漸降低，表明體系中溶解的Bis-Nph越來越少，同時最大吸收發(fā)生了紅移且變寬，表明分子間距變小，共軛程度增加，發(fā)生了聚集.由圖3（B）和圖4可以看到，在392 nm處，當(dāng)fw從0增加到50%時，Bis-Nph的熒光強(qiáng)度顯著增加；當(dāng)fw達(dá)到70%時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，是初始強(qiáng)度的30倍，表明分子的聚集減少了分子內(nèi)的非輻射躍遷，導(dǎo)致發(fā)射增強(qiáng)；當(dāng)fw從70%提高到100%時，Bis-Nph在392 nm處的熒光強(qiáng)度降低.而490 nm處的熒光強(qiáng)度則是隨著fw的不斷升高而逐漸增強(qiáng)，表明形成的激基締合物不斷增加，分子內(nèi)的輻射躍遷增多，從而抵消了部分AIE熒光強(qiáng)度.

Fig.3 UV(A)and FL(B,λex=335 nm,slit:2.0/0.5 nm)spectra of Bis?Nph in THF/water mixtures

Fig.4 FL intensities of Bis?Nph(20μmol/L)at 392 nm(A)and 490 nm(B)versus the water fraction in THF/water mixtures

Fig.5 Tyndall effect of Bis?Nph(20μmol/L)in dark(A)and white light(B)in different solvents

由于Bis-Nph可能在水相中發(fā)生團(tuán)聚形成納米顆粒，其溶液應(yīng)該具有丁達(dá)爾現(xiàn)象.用激光筆透過不同溶劑的Bis-Nph溶液（圖5），可以看到在以純水為溶劑的溶液形成了一條明亮的綠色光帶，而在其它溶劑中綠色光帶幾乎不可見，證明Bis-Nph在水中形成了納米顆粒.另外，采用激光粒度儀測試純水中Bis-Nph的平均粒徑為467.0 nm（圖S2，見本文支持信息）.

Fig.6 Photographs of Bis?Nph in THF under UV lamp(365 nm)(A),powder under the daylight(B)and UV lamp(365 nm)(C)

具有AIE效應(yīng)的分子在溶液中的熒光強(qiáng)度會隨著其濃度增大而增強(qiáng)，其原因是濃度增大導(dǎo)致分子間距離變小，使分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限，受到激發(fā)后非輻射躍遷減少，因此熒光更強(qiáng).用THF配制不同濃度的Bis-Nph溶液，在暗箱式紫外燈下（365 nm）進(jìn)行肉眼觀察［圖6（A）］，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Bis-Nph的濃度在1~100μmol/L時熒光較弱，當(dāng)濃度為1 mmol/L和10 mmol/L時，肉眼可見亮度明顯增強(qiáng)并在濃度為10 mmol/L時達(dá)到最亮.當(dāng)濃度繼續(xù)增大時，化合物因無法溶解而出現(xiàn)大量黃色固體.另外，Bis-Nph的固體粉末在紫外燈下也發(fā)出明亮熒光［圖6（C）］.經(jīng)測試其固態(tài)熒光量子產(chǎn)率為3.11%（圖S3，見本文支持信息），熒光壽命為0.36 ns（圖S4，見本文支持信息）.

2.3 對TNP的識別

通過向Bis-Nph溶液（V水∶VTHF=7∶3）中加入TNP溶液后記錄紫外和熒光光譜考察了Bis-Nph對TNP的響應(yīng)，結(jié)果見圖7.向Bis-Nph溶液中加入TNP溶液后，340 nm處的紫外吸收明顯增強(qiáng)，且肉眼可見溶液顏色由無色變?yōu)榈S色.溶液的熒光強(qiáng)度在加入TNP后顯著降低，加入濃度為200μmol/L的TNP后熒光猝滅效率為92.8%.

Fig.7 UV(A)and FL(B)spectra and relative photographs(insets)of Bis?Nph(20μmol/L)with the change of TNP concentrations(0—200μmol/L)

熒光靜態(tài)猝滅常數(shù)（Ksv）是評價傳感器的重要因素，可根據(jù)Stern-Volmer方程I0/I=1+Ksv［Q］計算得到.其中I0和I分別為未加和加入檢測物時的熒光強(qiáng)度，［Q］為檢測物的濃度.根據(jù)方程計算得到Ksv為5.34×104L/mol（圖S5，見本文支持信息）.當(dāng)TNP濃度在0~80μmol/L范圍內(nèi)時，識別具有較好的線性關(guān)系（R2=0.9845），根據(jù)檢出限（LOD）=3SB/m［其中SB為空白測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m為熒光強(qiáng)度與樣品濃度關(guān)系線的斜率（圖8）］計算出LOD為5.8×10?7mol/L，與文獻(xiàn)［31~34］報道的值相近，但這些文獻(xiàn)中報道的有機(jī)小分子探針都是在非水或含少量水的溶液中進(jìn)行檢測的（表S1，見本文支持信息），限制了它們的實際應(yīng)用.

由于在實際生產(chǎn)過程中不可避免地會接觸到TNP，例如爆炸裝置的制備和包裝，會導(dǎo)致少量TNP殘留在人的皮膚和衣物中，因此開發(fā)一種簡單、快速、低成本的檢測方法十分必要.為此，我們制作了一種簡便的試紙進(jìn)行了TNP殘留的快速檢測.將濾紙浸入到Bis-Nph溶液中，真空干燥，在365 nm紫外燈下可以看到未浸泡的濾紙無熒光［圖9（A）］，而浸泡過濾紙的有明顯的藍(lán)色熒光［圖9（B）］.將手指沾上微量TNP，并在濾紙上按壓數(shù)秒，紫外燈下可以清楚地觀察到暗斑［圖9（C）］.另外，用試紙可以檢測自來水中的TNP，肉眼可分辨的最低濃度為0.50 mmol/L，優(yōu)于文獻(xiàn)報道結(jié)果［10］（圖S6，見本文支持信息）.

Fig.8 Plot of the linear relation for the recognition of Bis?Nph to TNP

Fig.9 Photos of filter paper under UV light at 365 nm

2.4 對TNP的選擇性

選擇性是評價探針性能的一個重要指標(biāo).為了驗證探針Bis-Nph識別TNP的選擇性，進(jìn)行了探針對常見的爆炸物如TNT、DNT、硝酸甘油（NG）以及硝基苯（NB）的選擇性實驗.當(dāng)向探針溶液（20μmol/L，V水∶VTHF=7∶3）中加入2倍化學(xué)計量的各種待檢測物后，發(fā)現(xiàn)加入TNP后的熒光強(qiáng)度降低了64%，而加入其它待檢測物后熒光強(qiáng)度無明顯變化（<17%），表明探針Bis-Nph對TNP的識別具有選擇性［圖10（A）］.

為了進(jìn)一步證明探針Bis-Nph在其它爆炸干擾物存在下仍對TNP有較高的選擇性，進(jìn)行了干擾試驗.在過量的干擾物（40μmol/L）存在下，記錄了探針Bis-Nph（20μmol/L）識別TNP（40μmol/L）的熒光強(qiáng)度［圖10（B）］.可見，在干擾物存在的情況下，加入TNP后，溶液的熒光強(qiáng)度仍然明顯降低（>54%），表明Bis-Nph對TNP的識別不受其它爆炸干擾物的影響.

Fig.10 Selectivity(A)and anti?interference(B)of compound Bis?Nph to TNP

2.5 識別機(jī)理研究

利用1H NMR結(jié)果可以闡釋Bis-Nph與TNP之間的相互作用，但由于市售TNP為溶液，且含量較低（100μg/mL），不足以進(jìn)行1H NMR實驗，因此采用對硝基苯酚替代TNP進(jìn)行機(jī)理研究.向Bis-Nph的CDCl3溶液加入對硝基苯酚后，a和c位置的質(zhì)子信號向高場位移了0.02，b位置的質(zhì)子信號（Ar-H）向高場位移了0.03（圖11，圖S7，見本文支持信息），表明對硝基苯酚可以使Bis-Nph質(zhì)子化，導(dǎo)致其與對硝基苯酚陰離子之間發(fā)生了強(qiáng)的靜電相互作用，從而阻礙了Bis-Nph分子的ICT效應(yīng)，導(dǎo)致其熒光發(fā)生猝滅.

2.6 細(xì)胞毒性

采用MTT法測試了化合物Bis-Nph對肝癌細(xì)胞HepG2和嗜鉻細(xì)胞瘤PC12的體外毒性，結(jié)果（圖12）顯示，Bis-Nph在濃度為1μmol/L和5μmol/L時對兩種細(xì)胞的生存活力基本無影響，濃度高于5μmol/L時顯示出較弱的抑制作用，濃度為50μmol/L時兩種細(xì)胞株的生存活力仍接近60%，表明化合物在測試濃度下的細(xì)胞毒性較低.由于化合物在高濃度（100μmol/L）下無法完全溶解，會從培養(yǎng)基中析出，因此無法進(jìn)行高濃度的細(xì)胞毒性測試.

Fig.11 1H NMR spectra of Bis?Nph before(a)and after(b)adding p?nitrophenol

Fig.12 Effect of Bis?Nph on HepG2 and PC12 cell viability

3 結(jié) 論

設(shè)計合成了一個新的雙萘酰亞胺衍生物Bis-Nph并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和功能評價.結(jié)果表明，Bis-Nph是一種AIEE分子，能夠在水溶液中對TNP進(jìn)行檢測，其機(jī)制為TNP的酸性使萘酰亞胺上的羰基質(zhì)子化，阻斷了Bis-Nph的ICT發(fā)射，導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅.該探針檢出限為5.8×10?7mol/L，對TNP的識別不受其它爆炸物的干擾，且細(xì)胞毒性較低，能夠制備成試紙對TNP進(jìn)行簡便快速的定性檢測，具有良好的應(yīng)用前景.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210765.