黃 彪 吳建鴻

（1.福建省農產品質量安全重點實驗室,福建 福州 350003；2.福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,福建 福州 350003）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物，是我國傳統(tǒng)的中草藥，具有很高的藥用價值和經濟價值，在我國許多區(qū)域如廣東、福建、海南、浙江等地都有野生資源及人工栽培。鐵皮石斛的利用一般是將其莖部位烘干后加工成石斛楓斗、膠囊、石斛粉以供藥（食）用，也有將其新鮮莖部壓榨調配成飲品進行食用?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等作用[1-3]。鐵皮石斛中的活性成分包括多糖[4]、生物堿[5]、聯(lián)芐衍生物[6]、氨基酸[7]、菲[8]、類黃酮[9]、酚酸[10]等。酚酸是一類分子結構中含酚羥基與羧基的多酚類化合物，作為植物的次級代謝產物，在植物組織中廣泛存在，對植物的生理活動有著重要的影響。相關研究表明，酚酸類化合物具有良好的抗氧化、防癌抗癌、殺菌、抗炎等功效[11]。目前有關鐵皮石斛中酚酸類物質的研究報道較少[22]，因而研究分析鐵皮石斛中酚酸類物質的組成和含量具有重要的意義。

目前報道的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）[11]、高分辨質譜法（high resolution mass spectrometry,HRMS）[12]及高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）[13-14]。相對于HPLC，HPLC-MS/MS的選擇性更好，靈敏度更高，抗干擾能力更強，檢測更迅速，其在農產品質量安全檢測、環(huán)境污染物監(jiān)測、功能性食品活性成分的分析鑒定等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

隨著人們對養(yǎng)生健康日益重視，鑒于鐵皮石斛重要的藥用價值和保健價值，鐵皮石斛多樣性產品也被不斷開發(fā)出（如鐵皮石斛鮮條、鐵皮石斛花、鐵皮石斛酒等），食用方法也多樣化（烘干后食用或鮮食）。近些年鐵皮石斛各類產品的營養(yǎng)功能成分方面的研究越來越深入，但目前對鐵皮石斛活性組分的研究大多集中在鐵皮石斛加工后干樣中活性物質總含量的分析，而對其采收后鮮樣中活性組分的組成和含量分析的研究則相對較少，有關鐵皮石斛中酚類組分或酚酸類組分的分析研究報道更少。本研究在相關方法的基礎上，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）測定鐵皮石斛莖部鮮樣13種酚酸類物質的方法，以期為鐵皮石斛中活性成分的檢測與利用提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

本研究中使用的主要儀器包括UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Xevo TQ-S三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）、Millipore Direct-Q5超純水儀（蘇州賽恩斯儀器發(fā)展有限公司）、SYG-2水浴恒溫振蕩器（常州朗越儀器有限公司）、XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）。

1.2 材料與試劑

實驗樣品材料采集自福建省龍巖市連城縣、福州市閩侯縣鐵皮石斛產區(qū)，共6份鐵皮石斛莖部樣品（鮮樣）。

13種酚酸類化合物固體標準品：水楊酸（salicylic acid）、對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid）、3,5-二羥基苯甲酸（3,5-dihydroxybenzoic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）、香草酸（vanillic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、丁香酸（syringate）、對香豆酸（p-coumalic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、芥子酸（sinapic acid）、2-羥基肉桂酸（2-hydroxycinnamic acid）、3-羥基肉桂酸（3-hydroxycinnamic acid），純度≥97%，南京道斯夫生物技術股份限公司生產。甲醇、乙腈，質譜純，美國Merck公司；乙酸銨、甲酸，質譜純，美國Waters；Waters BEH C18柱、Waters T3 C18柱，Waters公司。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取一定量的各酚酸類化合物固體標準品，用甲醇溶解，配制成1 000 mg/L的各酚酸類化合物單標母液，然后稀釋母液配制成10.0 mg/L的單標儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。5個濃度梯度的標準混合溶液由各單標溶液經甲醇稀釋混合，實驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 超高效液相色譜-質譜條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱為Waters T3 C18柱（50 mm×1.8 mm，5 μm），柱溫保持在30.0 ℃，流速為0.2 mL/min，進樣量為4 μL。流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈。流動相梯度洗脫條件：0～4 min，30%～90% A；4～6 min，維持30% A；5～8 min，30%～50% A；8～9 min，50%～90% A；9～10 min，維持90% A。

1.4.2 質譜條件

檢測方式是電噴霧離子源負離子（ESI-）模式，多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓為1.5 kV；錐孔氣流為氮氣，流速50 L/h；脫溶劑溫度為500 ℃，流速800 L/h；離子源溫度為150 ℃；霧化氣壓力為0.28 MPa；碰撞氣為高純氬氣。質譜檢測定性、定量離子對及優(yōu)化后的錐孔電壓和碰撞能量等具體參數(shù)見表1。

表1 酚酸類化合物檢測的質譜參數(shù)條件

1.5 樣品前處理

鐵皮石斛中酚酸類組分的提取參考李巖等[9]（2018）的方法。稱取0.5 g磨碎后的鐵皮石斛鮮樣置于棕色錐形瓶中，加入70%甲醇水溶液10 mL,置于恒溫振蕩器中于70 ℃水浴條件下振蕩提取30 min，自然冷卻至室溫。將提取液轉移至離心管中，離心5 min（轉速5 000 r/min）后上清液轉移至10 mL的棕色容量瓶中。再將樣品用70%甲醇水溶液重復提取一次，合并提取液，定容至25 mL、搖勻。鐵皮石斛樣品提取液經0.45 μm濾膜過濾后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析運用Waters MassLynx軟件進行處理并用Excel 2007進行分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

在質譜儀上采用流動注射泵直接進樣方式對13種酚酸類組分檢測的質譜條件進行自動調諧優(yōu)化。用500.0 μg/L或者1 000.0 μg/L（根據(jù)各組分相應信號）各酚酸類化合物的單標溶液進行質譜參數(shù)優(yōu)化，以確定特征母離子和子離子對。根據(jù)文獻報道及酚酸類物質的官能團特點在ESI-模式下進行分析，在子離子掃描模式以及優(yōu)化的碰撞能量和錐孔電壓等質譜參數(shù)下，優(yōu)化獲得每種酚酸類組分穩(wěn)定且強度高的兩對離子對。

2.2 色譜柱的選擇

實驗中，分別使用Waters BEH C18柱和Waters T3 C18柱，考察在不同的流動相體系（甲醇+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸銨水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液）下所得13種酚酸類組分的峰型和響應信號。實驗發(fā)現(xiàn)：Waters T3 C18對酚酸類化合物有更好的分離效果，峰型尖銳。從多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖（如圖1）也可看出，在所檢測的目標化合物中，3,5-二羥基苯甲酸與2,5-二羥基苯甲酸，3-羥基肉桂酸與2-羥基肉桂酸互為同分異構體，其峰型雖然相似，但是保留時間有一定的差別，說明在優(yōu)化的條件下，這些同分異構體也能被T3 C18柱很好地分離，不會造成檢測干擾。

2.3 流動相體系的選擇

為考察在不同的流動相體系下酚酸類組分的峰型及響應甲信號，對不同流動相體系（甲醇）+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸銨水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液進行考察。結果表明：采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相，在負離子掃描模式下，大多數(shù)酚酸類化合物色譜峰基線相對平穩(wěn)，有良好的峰型及有更好的響應信號。各組分的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖如圖1。其原因可能是甲酸的加入有利于抑制酚酸類化合物氫離子的電離，減少其與色譜柱中填料中的基團的靜電作用，改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象；而乙酸銨的加入有利于酚酸類化合物負離子的形成，能增強響應信號。

圖1 13種酚酸類目標化合物多反應監(jiān)測色譜圖

2.4 標準曲線、檢出限及定量限

根據(jù)酚酸類化合物調諧優(yōu)化檢測參數(shù)時的響應情況，配制不同質量濃度梯度的混合標準溶液，得到5個梯度水平的標準曲線工作溶液。以各目標組分響應信號對應的峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X,μg/L），得出13種酚酸類組分的標準工作曲線方程。如表2所示，13種酚酸類組分在相應的線性范圍內具有良好的線性關系，決定系數(shù)大于0.996。檢出限（LOD）范圍為0.5～5.6 μg/L（S/N≥3），定量限（LOQ）范圍為1.5～15.2 μg/L（S/N≥10）。方法具有較低的檢出限和定量限。

表2 13種酚酸類目標化合物檢測的線性關系、檢出限及定量限

另外，在LC-MS樣品分析中，基質效應及共流出組分可能會影響定量分析的準確度。在所分析的組分中，酚酸類化合物的結構相似，部分酚酸類化合物的保留時間非常接近，實驗中為考慮共流出組分可能存在的相互影響，將待分析酚酸類化合物混標中該組分的標準曲線的斜率（k0）與單標標準曲線斜率（k1）進行了比較，其比值在0.90～1.10之間。用k0/k1的比值來確定基質效應，比值越接近1，基質效應越小。一般認為，斜率比在0.80～1.20之間，則認為基質效應或者共流出組分影響不明顯；反之，則認為基質效應對定量檢測具有較大的影響，不可忽略。從實驗結果來看，基質效應確實有一定影響，但斜率比在0.90～1.10之間（如圖2），對結果分析影響不明顯。

圖2 共存組分的影響考察

2.5 加標回收率實驗

根據(jù)樣品中酚酸類化合物的含量及標準，按照低、中、高水平加標確定各化合物的加標量，進行加標回收實驗，每個加標水平重復6次。實驗結果顯示，13種組分的加標回收率范圍為74.8%～95.2%，相應的相對標準偏差為1.0%～6.9%。由此可見，實驗加標回收率在70%～110%之間，回收率滿足檢測方法要求。

2.6 精密度實驗

隨機選擇1份樣品提取液，按照建立的方法進行分析檢測，平行進行6次測試。結果表明，所得酚酸類組分數(shù)據(jù)RSDs在0.046%～0.79%之間，說明該實驗方法具有良好的日內精密度，符合分析測定的要求。

2.7 鐵皮石斛樣品的檢測

將采集的樣品經前處理后，按所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）對鐵皮石斛樣品進行檢測分析。每次進樣量為4μL，重復測定3次取平均值。鐵皮石斛莖部鮮樣中所含酚酸類化合物的檢測結果如表2所示，鐵皮石斛莖部鮮樣共檢出7種酚酸類化合物，其含量在0.187～38.523 mg/kg范圍。在所分析的樣品中，阿魏酸含量最高，含量為30.32～38.523 mg/kg，其次是芥子酸、丁香酸、水楊酸等，對香豆酸的含量最低。

表3 鐵皮石斛鮮樣莖部中酚酸類化合物組分及其含量（n=3，單位：mg/kg）

3 結論與討論

相對于高效液相色譜法（HPLC），超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS-MS）具有靈敏度高、抗干擾能力強、檢測線性范圍寬、分析快速的等特點，能夠較好地實現(xiàn)樣品中多組分的快速定性、定量分析，在糧油、中草藥、功能性食品相關檢測方面發(fā)揮出越來越大的作用。鐵皮石斛作為“九大仙草之首”，具有良好的保健和藥用價值。藥典中以石斛多糖、甘露糖及醇浸出物作為鐵皮石斛質量控制的指標。而現(xiàn)代科學研究表明，鐵皮石斛中其他功能性成分如石斛堿、植物酚類、黃酮類和酚酸類等也有重要生理活性作用。酚酸類化合物含量被認為與自由基清除、抗氧化、抗衰老相關，但是相關對鐵皮石斛鮮樣中酚酸類化合物的研究較少。原因在于植物性農產品鮮樣中所含水分較多且其功能性成分含量較低，諸多儀器的靈敏度較難達到；另一方面由于酚酸類化合物種類較多，而有些酚酸類化合物的結構較為類似，在樣品中的含量高低差別卻往往較大，從而較難實現(xiàn)不同含量酚酸類化合物的同時檢測。

本研究建立了同時、快速檢測13種酚酸類化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS-MS），分析了鐵皮石斛莖部鮮樣中多種酚酸類物質的含量。該方法快速、準確，可為鐵皮石斛或者其他植物性農產品中的酚酸類物質的檢測提供參考。