許振勝 符芳姿 孫南陽(yáng)

(1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院腫瘤化療科，海南省?？谑?570208，電子郵箱:22247316@qq.com；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，湖南省長(zhǎng)沙市 410005)

骨肉瘤是小兒和青少年惡性程度最高的骨癌之一，2/5的骨肉瘤患者確診時(shí)疾病已處于晚期，僅有1/5的骨肉瘤患者生存期較長(zhǎng)[1]。經(jīng)過20多年的研究探索，目前使用的新輔助化療+手術(shù)和放療+化療+靶向藥物等方式治療骨肉瘤已從很大程度上改善患者的預(yù)后，但由于腫瘤對(duì)化療耐藥、對(duì)放療不敏感等問題，患者的總生存率仍未得到明顯提高[2]。因此，如何改善骨肉瘤患者的預(yù)后仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，研究一種高效低毒的方法治療晚期骨肉瘤迫在眉睫。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，大量研究結(jié)果表明，抑制mTOR通路可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[3-7]。例如，β-欖香烯通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/mTOR信號(hào)通路上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α蛋白表達(dá)，有助于抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡[7]。這提示抑制mTOR通路可以作為治療骨肉瘤的潛在方法。

部分中藥及食品均含有槲皮素，它具有多種生物活性，能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[8]。我們前期研究表明，槲皮素可顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖，使其停滯在細(xì)胞周期G1期，且以上作用具有明顯的劑量和時(shí)間依賴性；同時(shí)槲皮素可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[9-10]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究槲皮素對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響，并探討槲皮素是否是通過阻斷骨肉瘤MG-63細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR通路以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，從而為槲皮素治療骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng) 人骨肉瘤 MG-63細(xì)胞株來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。用6 mL加入胎牛血清和雙抗的高糖杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM，美國(guó)Gibco公司)將MG-63細(xì)胞沉淀重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、飽和濕度及5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)及貼壁程度，96 h后將細(xì)胞傳代再培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑與儀器 槲皮素由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)：100081-201708)。Tris緩沖液購(gòu)自雷根生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：PE0080)；10%聚丙烯酰胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：S31321、S24295)；蛋白磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液均購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：S21023、ML4313)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司(批號(hào):1263)；碘化丙啶購(gòu)自京凱基生物科技發(fā)展有限公司(批號(hào)：KGA511)；二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：A045-4-2)；Akt、mTOR抗體購(gòu)自上海莼試生物(批號(hào)：CS10044、CS10787);磷酸化Akt(phosphorated Akt,p-Akt)抗體、磷酸化mTOR(phosphorated mTOR,p-mTOR)抗體購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：GOYK96479、GOYK96849)；內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)：HK13769)；辣根過氧化物酶購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司(批號(hào)：ZY424)；ECL試劑購(gòu)自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：WBKIS0100)。超凈工作臺(tái)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司 )；電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；Attune?NxT流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.3 細(xì)胞分組與干預(yù) 取細(xì)胞，先用PBS洗去培養(yǎng)液， 0.25%胰蛋白酶常溫消化2 min后，細(xì)胞形態(tài)變圓，貼壁細(xì)胞部分脫落，吹打后制成細(xì)胞懸液，以(4～5)×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞懸液100 μL，96孔板最外圍一圈只加入培養(yǎng)基，以減少液體蒸發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組中，加入含0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL作為溶劑對(duì)照。根據(jù)前期研究結(jié)果，與0 μg/mL槲皮素比較，50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL和250 μg/mL槲皮素均可顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞活力，其中200 μg/mL槲皮素可顯著增加骨肉瘤MG-63細(xì)胞的晚期凋亡率和壞死，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[9-10]。因此本實(shí)驗(yàn)采用200 μg/mL槲皮素50 μL干預(yù)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。加入相關(guān)藥物干預(yù)細(xì)胞后，將96孔板放置CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取干預(yù)后48 h的兩組細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min，待細(xì)胞形態(tài)變圓，貼壁細(xì)胞部分脫落，吹打后制成細(xì)胞懸液，加入至15 mL離心管調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。在低速離心機(jī)上離心10 min(1 000 r/min，4℃)后小心棄去上清，加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液。使用300目尼龍過濾上述細(xì)胞懸液后，再使用低速離心機(jī)離心10 min(1 000 r/min，4℃)，小心棄去上清，加入PBS 1 mL制成細(xì)胞懸液，重復(fù)2次。將上述經(jīng)多次離心清洗后的細(xì)胞用200 μL PBS再次吹打至細(xì)胞懸液。加入800 μL 預(yù)冷的75%乙醇固定2 h以上，并放置于4℃冰箱避光過夜。然后使用低速離心機(jī)離心(1 000 r/min，4℃)10 min，棄去上清，加入1 mL PBS再次吹打制成細(xì)胞懸液，重復(fù)1次；將重懸細(xì)胞加入500 μL的PBS緩沖液中(預(yù)先配成含100 U/mL RNaseA的PBS)，避光孵育30 min。加碘化丙啶至終濃度為50 μg/mL，室溫避光30 min。過濾后使用流式細(xì)胞儀分析各周期的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Akt和mTOR蛋白表達(dá)及磷酸化蛋白表達(dá)水平 取干預(yù)后的兩組細(xì)胞，每組細(xì)胞加3 mL 4℃預(yù)冷的PBS，洗滌細(xì)胞2～3次；加入400 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后在4℃下12 000 r/min離心5 min，隨后采用蛋白定量BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。制膠、預(yù)電泳，然后計(jì)算需要加樣樣品的體積，按照緩沖液與樣品體積比為4 ∶1的比例加入緩沖液，沸水煮10 min；依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，每個(gè)泳道5 μL；加樣完畢后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，約80 min；設(shè)定恒壓20 V轉(zhuǎn)模，4℃冰箱中過夜；用TBST液洗滌印跡膜10 min，重復(fù)2次，然后放入5%脫脂奶粉封閉液中，搖床震動(dòng)，70 r/min，室溫封閉1 h。分別加入一抗Akt(1 ∶2 000稀釋)、p-Akt(1 ∶2 000稀釋)、mTOR(1 ∶1 000稀釋)、p-mTOR(1 ∶1 000稀釋)、內(nèi)參β-actin(1 ∶4 000稀釋)，4℃冰箱中孵育24 h。TBST沖洗3次，經(jīng)過1 ∶2 000稀釋的KPL(用辣根過氧化物酶耦合后)在常溫孵育1 h；孵育結(jié)束后用TBST沖洗3次，使用ECL 試劑顯影、曝光后，使用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期分布情況 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的G1期細(xì)胞比例增加，而S期細(xì)胞比例減少(均P<0.05)，但兩組G2期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖1。

表1 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期分布的比較(x±s，%)

圖1 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期分布情況

2.2 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞Akt和mTOR蛋白表達(dá)及磷酸化蛋白表達(dá)水平的比較 干預(yù)后48 h，實(shí)驗(yàn)組的p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，但兩組Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2和圖2。

表2 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞Akt和mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平及磷酸化蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 兩組骨肉瘤MG-63細(xì)胞Akt、mTOR總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平

3 討 論

細(xì)胞周期是指細(xì)胞分裂完成后至下一個(gè)分裂結(jié)束的整個(gè)過程，一般分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)及細(xì)胞分裂期(M期)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，給予槲皮素干預(yù)后大多數(shù)MG-63細(xì)胞停滯在G1期，這表明槲皮素可使骨肉瘤細(xì)胞停滯在DNA合成前期，從而有效抑制骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA合成。這與其他研究結(jié)果[11]相似，提示骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯在G1期與槲皮素增加了細(xì)胞G1/S期骨肉瘤細(xì)胞數(shù)目有關(guān)。由此可見，槲皮素可通過影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖，而發(fā)揮治療骨肉瘤的作用。

PI3K-Akt-mTOR介導(dǎo)的信號(hào)通路是與mTOR有關(guān)的主要關(guān)鍵通路，通路中的Akt主要被上游的PI3K激活,Akt的磷酸化程度可以間接反映PI3K的活化水平，此外磷酸化的Akt可直接激活mTOR。癌癥的發(fā)生是一個(gè)多階段的過程，在此過程中，負(fù)責(zé)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和分裂的信號(hào)通路的活性被破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡受到抑制，細(xì)胞的增殖得到增強(qiáng)。PI3K-Akt-mTOR是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路之一，在癌細(xì)胞中該通路處于過度激活狀態(tài)，從而抑制了癌細(xì)胞的自噬死亡，因此抑制該通路的激活可以起到一定抗癌作用[12]。本課題組前期研究表明，槲皮素可抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡，促進(jìn)MG-63細(xì)胞自噬進(jìn)程，誘發(fā)細(xì)胞自噬[9-10]。而mTOR是細(xì)胞凋亡和自噬過程的共同上游調(diào)控靶點(diǎn)[5-6，13]，且mTOR的激活與骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。由此推測(cè)，抑制mTOR通路的激活可作為治療骨肉瘤的候選策略。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，表明槲皮素可抑制MG-63細(xì)胞內(nèi)Akt和mTOR的磷酸化、PI3K的活化(Akt磷酸化的程度可以間接反映PI3K活化的水平)，這表明槲皮素能有效抑制PI3K-Akt-mTOR通路的激活，這或許是其發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。在其他研究中，槲皮素也表現(xiàn)出類似的生物學(xué)效應(yīng)：如槲皮素可以通過Akt-mTOR途徑上調(diào)高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞的自噬[14]；槲皮素能夠有效地抑制肝惡性腫瘤細(xì)胞SMMC-7721的增殖，其機(jī)制可能是使SMMC-7721細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，通過上調(diào)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因的表達(dá)抑制Akt活化從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。以上研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了本實(shí)驗(yàn)的可靠性。

綜上所述，槲皮素可能通過阻斷PI3K-Akt-mTOR通路阻滯骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗骨肉瘤效應(yīng)。該通路或成為槲皮素抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的主要靶點(diǎn)，為相關(guān)抗癌藥物的研發(fā)提供理論數(shù)據(jù)支持。但槲皮素是否存在其他調(diào)控通路發(fā)揮抗腫瘤作用仍需進(jìn)一步研究。