尚玉婷，楊 薇，張 民

（1 天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院 天津 300392 2 天津農(nóng)學院基礎科學學院 天津 300392）

小麥是溫帶國家的主要糧食作物[1]，為人體提供必需氨基酸、礦物質、維生素以及有益的植物化學物質和膳食纖維成分等[2]。然而，由于小麥中富含淀粉、蛋白質、脂肪等營養(yǎng)物質，有助于微生物的生長，若存儲不當，則會引起小麥發(fā)霉變質[3-4]，造成嚴重經(jīng)濟損失，并產(chǎn)生真菌毒素危害人體健康[5-6]。小麥的霉變可能發(fā)生在收割、儲存、運輸、銷售多個階段，由于儲存占整個周期比重最大，最易發(fā)生霉變。糧庫內(nèi)環(huán)境的溫度、濕度是決定小麥霉變的關鍵因素[7-8]。全世界約有5%～7%的糧食每年因被霉菌侵染而不可食用[9]。控制霉菌生長是糧食倉儲的主要任務。明晰小麥倉儲過程中霉菌的變化規(guī)律及霉菌活動對小麥品質的影響，有利于對實際倉儲小麥進行有針對性的預防，以減少小麥倉儲損失，保護良好品質[10-11]。

為了研究北方糧庫中經(jīng)磷化鋁環(huán)流熏蒸過的硬質白小麥儲藏過程中霉變的影響因素，本試驗通過分析天津市7～10月糧倉內(nèi)儲藏環(huán)境的變化，選取該段時間內(nèi)溫、濕度較高的儲藏條件，對小麥進行模擬儲藏。跟蹤測定儲藏期間小麥的各項理化指標，并用高通量測序技術探究模擬儲藏期間小麥的微生物群落結構變化，探明小麥發(fā)生的品質變化。

1 材料和方法

1.1 材料

硬質白小麥，2020年產(chǎn)地為河北省，倉房位于天津市靜海區(qū)（經(jīng)緯度117.2E，39.13N），倉房類型為高大平房倉，入庫前采用磷化鋁環(huán)流熏蒸，2020年8月入庫后測得小麥水分為10.85%，最高倉溫36.3 ℃，最低倉溫18.8 ℃，倉內(nèi)濕度61.9%。

1.2 試劑

HiPure Soil DNA Kit 土壤DNA 基因組提取試劑盒，OMEGA 公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，AXYGEN 公司；PCR 所用試劑，大連寶生物公司。

1.3 儀器與設備

SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CM-5 分光測色計，日本柯尼卡美能達有限公司；101-1AB 電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；NM120-Analyst 核磁共振成像分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；HERACLES Ⅱ快速電子氣味分析儀，法國ALpha Mos 公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2 超凈臺，孚夏超凈工作臺；9700 型PCR 儀，美國ABI GeneAmpR公司；高通量測序儀，Illumina 公司；臺式離心機，德國艾本德股份公司；凝膠成像系統(tǒng)，莫納生物科技有限公司；EPS6000 電泳儀，Tanon。

1.4 方法及測定指標

1.4.1 方法 取樣方法依據(jù)GB/T 5491-1985《糧食、油料檢驗扦樣、分樣法》[12]。取樣后將樣品放置于樣品袋中，4 ℃?zhèn)溆?。為避免每次取樣存在分層誤差以及雜菌污染，本試驗將500 mL 三角瓶（空瓶）用棉繩將邊長為20 cm 的8 層紗布系于瓶口，準備完畢后高壓蒸汽滅菌，待冷卻后在超凈臺中取150 g 小麥置于瓶中，放置于殺菌后的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取第0，20，40，60，80，100，120 天的小麥進行試驗。

1.4.2 理化指標

1）色差 用色差儀測定樣品色值，記錄L*、a*、b*值的變化。L*值代表亮度，a*值代表紅綠度，b*值代表黃藍度。

2）水分 按照GB 5009.3-2016 《食品安全國家標準 食品中水分的測定》 第一法 直接干燥法[13]進行測定。

3）蛋白質 按照GB 5009.5-2016 《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》 第一法 凱氏定氮法[14]進行測定。

4）脂肪 按照GB 5009.6-2016 《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》 第二法 酸水解法[15]進行測定。

5）淀粉 按照GB 5009.9-2016 《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》 第二法 酸水解法[16]進行測定。

6）脂肪酸值：按照GB 5009.168-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》 第一法 內(nèi)標法[17]進行測定。

7）小麥外部霉菌量：參照GB 4789.15-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》第一法 霉菌和酵母平板計數(shù)法[18]測定。

1.4.3 基因組DNA 提取及PCR 過程 按照DNA提取試劑盒說明操作步驟，提取小麥總DNA，每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris_HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測，合格樣品保存待用。

以環(huán)境樣本中微生物總DNA 為模板，真菌擴增區(qū)域為ITS1 區(qū)，引物為ITS1F、ITS2R[19]，PCR 擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退 火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增32 個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。PCR 采用25 μL 反應體系：5×FastPfu Buffer （5 μL），2.5 mmol/L dNTPs（2.5 μL），上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase（0.5 μL），BSA（0.25 μL），Template DNA（10 ng），ddH2O 補足至25 μL。

1.4.4 高通量測序 將純化后的PCR 產(chǎn)物送至元莘生物公司，采用Illumina PE250 高通量測序平臺進行文庫構建和上機測序。Illumina PE250測序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區(qū)分樣本后進行操作分類單元 （Operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學分析，基于OTU聚類分析結果，可以對OTU 進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

理化指標使用SPSS 26.0 軟件分析比較，測試試驗均重復3 次。使用Origin 2021 軟件作圖，使用Excel 軟件做表。

Illumina PE250 測序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU 聚類分析和物種分類學分析，基于OTU 聚類分析結果，可以對OTU 進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎上，可以進行一系列群落結構和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 營養(yǎng)成分分析

2.1.1 小麥籽粒與面粉色澤變化 小麥質量與顏色密不可分，然而感官評價中人眼會受到視覺偏好的影響[20]，為了消除此影響，用色差儀記錄小麥模擬儲藏期間籽粒顏色及面粉顏色的變化，小麥籽粒黃色素是影響小麥面粉色澤的主要因素之一[21]。如圖1～3 所示，在小麥模擬儲藏過程中，在30 ℃，60%RH 條件下，L*值變化不明顯，兩種條件下小麥粒和小麥粉a*和b*色差變化不明顯且趨勢基本一致。在40 ℃，80%RH 條件下，小麥粒和小麥粉的L*值變化明顯，呈下降趨勢，其原因可能為此條件下微生物活躍，使得小麥表面滋生霉菌進一步導致顏色加深[22]，小麥色差L*值變化間接反應出小麥品質變化。

圖1 小麥色差L*值變化Fig.1 Wheat color difference L* value change

圖2 小麥色差a*值變化Fig.2 Wheat color difference a* value change

2.1.2 水分變化

2.1.2.1 國標法檢測 小麥的儲存受溫度和水分制約，溫度和水分越高安全性越低，自然條件下小麥的安全儲存水分含量應控制在8%～14%之間[23]。如圖4所示，在0～120 d 儲藏過程中，小麥籽粒中的水分含量逐漸升高。在30 ℃，60%RH 環(huán)境下儲藏的小麥水分仍可以保持在安全水分以下，且未發(fā)現(xiàn)肉眼可見菌絲體。在40 ℃，80%RH 條件下，儲藏的小麥在80 d 時水分含量為14.96%，超過安全水分，此時可在小麥表面發(fā)現(xiàn)明顯的菌絲體。

圖3 小麥色差b*值變化Fig.3 Wheat color difference b* value change

圖4 小麥水分變化Fig.4 Wheat moisture changes

2.1.2.2 MRI 檢測水分遷移變化 利用核磁共振成像分析儀的弛豫譜圖分析小麥籽粒水分內(nèi)部變化。通過分析得出，小麥在模擬儲藏過程中存在3種狀態(tài)的水，如圖5從左至右分別為：T21（0.1～10 ms） 強結合水、T22（10～100 ms） 弱結合水、T23（10～1 000 ms）自由水。模擬倉儲中，小麥中水分主要以強結合水（T21）的形式存在，流動性差，與非水組分如淀粉、蛋白質或其它大分子物質通過水-離子、水-偶極締合作用緊密結合[24]。由圖5可知，從第0 天開始，隨著儲藏時間延長，T21、T22弛豫時間變長，曲線開始向右移，在兩種溫度條件下，變化趨勢基本一致，40 ℃、80%RH 條件下較30 ℃、60%RH 條件下峰頂點時間遷移更快。在40 ℃環(huán)境下，由圖6b 可知，強結合水與弱結合水所占比例增加，表明水分和底物結合由緊密變稀疏[25]。

圖5 小麥橫向弛豫時間T2 平面圖（a）T2 直觀圖（b）Fig.5 Wheat transverse relaxation time T2 plane diagram （a） T2 intuitive diagram （b）

由圖6可知，強結合水的峰面積（A21）在兩種條件下有緩慢增加的趨勢。在30 ℃、60%RH 環(huán)境下弱結合水峰面積（A22）無變化，自由水峰面積由8%減少至6%；在40 ℃、80%RH 環(huán)境下弱結合水峰面積（A22）由占比2%增加至8%，自由水峰面積有減小趨勢，由占比8%減小至1%，變化明顯，說明可能此條件下流動性較大的自由水為環(huán)境中微生物提供了水分，結合出現(xiàn)可見菌絲體結果說明此條件不易于小麥儲存。

圖6 3 種狀態(tài)水的比例：30 ℃、60%RH 環(huán)境（a）和40 ℃、80%RH 環(huán)境（b）Fig.6 The proportion of water in the three states：30 ℃，60%RH （a） and 40 ℃，80%RH （b）

2.1.3 蛋白質變化 如圖7所示，結果表明隨著模擬倉儲時間的延長，在0～30 d 時蛋白質含量在12.5%左右波動，而后呈上升趨勢，在40 d 時達到15.2%，而后趨于平穩(wěn)。這可能是由于新收獲的小麥籽粒中含有大量低分子質量蛋白質，在高溫、高濕條件下儲藏，會促使其快速進入萌動期，導致小麥籽粒中醇溶性蛋白的肽鏈之間發(fā)生氧化反應形成二硫鍵，再次聚合成大分子谷蛋白，從而導致蛋白質含量增加[26]。

圖7 小麥蛋白質變化Fig.7 Wheat protein changes

2.1.4 淀粉變化 淀粉是小麥中含量最高，也是最重要的碳水化合物，約占小麥質量的57%～67%。如圖8所示，小麥在儲藏過程中淀粉含量在67.1%～68.8%范圍內(nèi)波動，沒有明顯變化。

圖8 小麥淀粉變化Fig.8 Wheat starch changes

2.1.5 脂肪變化 脂類是小麥重要營養(yǎng)物質之一，含量雖少，卻是儲藏過程中關鍵指標，脂肪氧化分解[27]會導致小麥產(chǎn)品品質劣變。如圖9所示，剛收獲的小麥籽粒中脂肪含量為1.8%，隨著儲藏時間延長，當儲藏時間為40 d 時，呈明顯下降趨勢。且隨著儲藏時間延長，在40 ℃、80%RH 條件下，脂肪含量下降較快，80 d 時達到1.3%，下降了約28%。

圖9 小麥脂肪變化Fig.9 Wheat fat changes

2.1.6 脂肪酸的變化 小麥籽粒中含有一定量的脂肪酸[28]，其中亞油酸為不飽和脂肪酸，其含量占總脂肪酸的60%[29-30]，是小麥中重要的營養(yǎng)成分。如圖10所示，剛收獲的小麥總脂肪酸含量為1.95 mg/100 g，在儲藏0～120 d 內(nèi)總脂肪酸總體呈下降趨勢。在40 ℃、80%RH 條件下，儲藏120 d 時總脂肪酸為1.39 mg/100 g，與剛入庫時相比降低了約29%。

圖10 小麥總脂肪酸變化Fig.10 Changes in total fatty acids in wheat

如圖11所示，在所有樣品中共檢測到6 種主要脂肪酸，小麥脂肪酸中亞油酸含量最多且變化趨勢與總脂肪酸趨勢基本一致，在兩種儲藏條件下，小麥中亞油酸含量均呈下降趨勢，由剛入庫的1.16 mg/100 g 到儲藏120 d 時30 ℃環(huán)境下0.804 mg/100 g，下降了約30%。在40 ℃、80%RH 條件下，小麥籽粒中的亞油酸含量下降更快，在第60天時下降至0.694 g/100 g，而在30 ℃、60%RH 條件下，亞油酸含量下降較為平緩，80 d 時降至0.81 mg/100 g。由此可見，高溫、高濕環(huán)境下儲藏小麥，可以加速其籽粒中亞油酸的氧化，降低小麥的營養(yǎng)價值。

圖11 小麥各脂肪酸變化Fig.11 Changes of fatty acids in wheat

2.2 微生物群落結構與多樣性分析

2.2.1 儲藏過程中小麥α 多樣性分析 表1為小麥模擬儲藏過程中，各階段樣品的多樣性指數(shù)。在30 ℃、60%RH 條件下，隨著儲藏時間的延長，Shannon 指數(shù)、Ace 指數(shù)、OTU 數(shù)目均逐漸增大，表明小麥中真菌多樣性與豐富度逐漸增大。在40℃、80%RH 條件下，Shannon 指數(shù)、Ace 指數(shù)、OTU數(shù)目先增大后減小，表明小麥菌絲體增長速度較快，各種微生物迅速生長，儲藏60 d 時，Shannon指數(shù)為0.02，小麥中真菌多樣性大大降低，某種有害菌占比極高，菌絲體已顯現(xiàn)。在40 ℃、80%RH條件下的小麥微生物群落變化程度遠高于30 ℃、60%RH 條件下的小麥，結果表明，高溫、高濕的儲藏條件更易產(chǎn)生菌絲體。

表1 真菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of fungal community diversity index

2.2.2 樣品所含OTU 數(shù)目分析 圖12為在30℃、60RH%及40 ℃、80RH%儲藏條件下，不同儲藏時間的真菌OTU 數(shù)目維恩圖，在30 ℃、60RH%條件下，不同儲藏時間共有OTU 87 個，原糧含有特有OTU 5 個，40 d 樣品含有特有OTU 6 個、60 d樣品含有特有OTU 11 個，80 d 樣品含有特有OTU 15 個，120 d 樣品含有特有OTU 19 個。隨儲藏時間延長，樣品中特有OTU 數(shù)目逐漸增加，表示不斷有新的微生物出現(xiàn)。在40 ℃、80RH%條件下，不同儲藏時間共有OTU 23 個，原糧含有特有OTU 6 個，20 d 樣品含有特有OTU 21 個，40 d 樣品含有特有OTU 39 個，60 d 樣品含有特有OUT 0 個，120 d 樣品含有特有OTU 1 個。隨儲藏時間延長，樣品中特有OTU 數(shù)目先迅速增加，后減少為0，表示群落變化十分迅速，60 d 后小麥中優(yōu)勢霉菌占比很大。

圖12 小麥真菌群落維恩圖：30 ℃、60RH%環(huán)境（a）和40 ℃、80RH%環(huán)境（b）Fig.12 Venn diagram of wheat fungus community：30 ℃，60RH% environment （a） and 40 ℃，80RH% environment （b）

2.2.3 貯藏期小麥真菌群落結構變化 為達到最佳視圖效果，在眾多檢出微生物中，將豐度低于1%的部分合并在其它（Other）中表示（圖13）。

圖13為不同儲藏時間小麥樣品中真菌群落結構，鏈格孢屬（Alternaria）為儲藏過程中的優(yōu)勢菌屬，隨著儲藏時間延長，其相對豐度呈逐漸下降的趨勢。在30 ℃、60%RH 的樣品中，儲藏120 d時，曲霉屬（Aspergillus）被檢出，且相對豐度較高，表明在80～120 d 儲藏階段，小麥中有害菌屬豐度升高。此時未發(fā)現(xiàn)肉眼可見菌絲體（圖14a）。在40℃、80%RH 的樣品中，儲藏40 d 時，鏈格孢屬（Alternaria）相對豐度最高，且優(yōu)勢明顯；儲藏60 d后，曲霉屬（Aspergillus）的相對豐度達100%，表明在40～60 d 儲藏階段，小麥微生物群落變化迅速；儲藏60 d 后，小麥中微生物均為曲霉屬（Aspergillus），小麥上可明顯觀察到菌絲體（圖14b）。

圖13 小麥屬水平群落組成：30 ℃、60RH%環(huán)境（a）和40 ℃、80RH%環(huán)境（b）Fig.13 Triticum horizontal community composition：30 ℃，60RH% environment （a） and 40 ℃，80RH% environment （b）

圖14 小麥儲藏120 d 后實況：30 ℃、60RH%環(huán)境（a）和40 ℃、80RH%環(huán)境（b）Fig.14 The actual condition of wheat after storage for 120 days：30 ℃，60RH% environment （a） and 40 ℃，80RH% environment （b）

2.2.4 儲藏過程中小麥β 多樣性分析 根據(jù)樣品在PCA 圖中的距離可判斷樣品間的相似度，如圖15a 所示，圖中A 組為原糧組，B 組為30 ℃存放的樣品，C 組為40 ℃存放的樣品。已產(chǎn)生菌絲體的樣品（40 ℃，60 d；40 ℃，120 d）和有變霉趨勢的樣品（30 ℃，120 d）距離其它樣品距離較遠，得到明顯區(qū)分。層級聚類圖中樹枝間的距離表示不同樣本的距離，結果顯示：所有樣品可分為3 類，產(chǎn)生菌絲體的小麥（40 ℃，60 d；40 ℃，120 d）為一類，有變霉趨勢的小麥（30 ℃，120 d）為一類，情況良好的樣品（0 d；30 ℃，40 d；30 ℃，60 d；30 ℃，80 d；40 ℃，20 d；40 ℃，40 d）為一類。

圖15 不同儲藏時間小麥PCA 分析（a）與層級聚類分析（b）Fig.15 PCA analysis of wheat in different storage periods （a） and hierarchical cluster analysis （b）

2.2.5 小麥外部霉菌數(shù)量變化 對小麥表面霉菌數(shù)量進行監(jiān)測，可以間接反應小麥在儲藏過程中的品質變化。結果如表2所示，在30 ℃、60%RH條件下儲藏120 d，小麥表面的霉菌數(shù)量整體波動不大，在40 ℃、80%RH 條件下儲藏40 d 后，霉菌數(shù)量呈指數(shù)增加。由此可見，溫度、濕度越高，小麥表面霉菌數(shù)量變化的速度越快。

表2 小麥霉菌計數(shù)結果Table 2 Wheat mold count results

3 結論

本文通過實驗室模擬小麥在30 ℃、60%RH和40 ℃、80%RH 高溫高濕條件下的倉儲過程，監(jiān)測小麥中水分、蛋白質、淀粉、脂肪等品質指標。結果表明，在30 ℃、60%RH 條件下，儲藏120 d 內(nèi)，小麥品質呈緩慢下降趨勢。在40 ℃、80%RH 條件下儲存的小麥，品質劣變比較明顯，儲藏60 d 后小麥表面出現(xiàn)明顯的菌絲體。通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)，儲藏前期小麥中優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬（Alternaria），當水分超過安全范圍后，其相對豐度迅速下降，曲霉屬（Aspergillus）逐漸成為優(yōu)勢菌屬，相對豐度迅速上升。在40 ℃、80%RH 條件下，儲藏60 d 的樣品中檢出微生物均為曲霉屬（Aspergillus），小麥表面出現(xiàn)明顯可見菌絲體。結果表明隨著溫度與相對濕度的上升，小麥曲霉屬菌株迅速上升。