朱文卿，朱姍姍，何秋霞，鄭振佳*

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 泰安 271018 2 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所 濟(jì)南 250103）

多糖作為天然高分子物質(zhì)，常被用于結(jié)合活性物質(zhì)以改善食品的質(zhì)地、可加工性和穩(wěn)定性等，也被用作穩(wěn)定劑、藥物載體和某些疾病的輔助治療劑[3]。將多糖與活性物質(zhì)結(jié)合制備復(fù)合物，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)組分的靶向遞送，而且有助于活性成分發(fā)揮協(xié)同作用。常見的菊糖、葡聚糖、果膠、變性淀粉等多糖可與黃酮、單寧等多酚類構(gòu)建復(fù)合物，發(fā)揮協(xié)同降血糖、抗菌和改善腸道環(huán)境的作用[4-5]。然而，目前多糖與多酚協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用的研究報道較少。研究多糖與多酚的協(xié)同抗氧化作用，有針對性地探究科學(xué)配比，是獲取新型抗氧化劑的重要方法。

牛蒡中含有豐富的多糖和多酚。牛蒡多糖中含量較高的是菊糖，約占牛蒡干重的34%[6-7]。菊糖為線性直鏈結(jié)構(gòu)，主要由12 個呋喃型的果糖以β-2，1-糖苷鍵相連[8]。研究表明牛蒡多糖具有抗氧化，降血糖，免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，且易于制備，安全性和穩(wěn)定性良好，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[9-11]。牛蒡中多酚類物質(zhì)主要為咖啡?？鼘幩犷?，包括咖啡酸、綠原酸和異綠原酸等[12]，其中綠原酸含量較高[13]，該成分具有良好的抗氧化，抗菌、消炎、抗病毒、降血糖、降血壓等多種生物活性，在食品和醫(yī)藥方面應(yīng)用廣泛[14]。

基于牛蒡多糖與綠原酸均具有良好的體內(nèi)抗氧化作用，本研究推測兩者復(fù)合后可能有體內(nèi)協(xié)同抗氧化的作用，并進(jìn)行驗(yàn)證。研究通過構(gòu)建斑馬魚氧化損傷模型，篩選體內(nèi)協(xié)同抗氧化作用最強(qiáng)的牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物比例，并對該復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征與體內(nèi)、外抗氧化活性評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：牛蒡，江蘇沛縣軼偉食品有限公司；綠原酸，成都曼斯特生物科技有限公司；轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚CY17（krt4-NTR：GFP），山東省科學(xué)院生物研究所。

試劑：氯仿、正丁醇、無水乙醇，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；甲硝唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH），梯希愛 （上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽（ABTS）、水楊酸，源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀、硫酸亞鐵，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl 緩沖液，鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鄰苯三酚，索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；SOD 測試盒、CAT 測試盒、MDA 測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus IX53 顯微鏡，日本Olympus 公司；Centrifuge 5804R 冷凍離心機(jī)，Eppendorf 德國專業(yè)生命科學(xué)公司；HPG-280BX 恒溫培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SPECTRO star Nano 全波長酶標(biāo)儀，廣州伯齊生物科技有限公司；UV2450 分光光度計，日本島津公司；Nicolet iS 10 傅里葉變換紅外光譜，美國賽默飛世爾科技公司；Zetasizer-Nano-ZS 激光納米粒度儀，英國馬爾文公司；SUPRATM55 掃描電子顯微鏡，德國蔡司公司；EMPYREAN 銳影X 射線衍射儀，荷蘭帕納科公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物體內(nèi)協(xié)同抗氧化的最佳比例篩選 通過構(gòu)建甲硝唑誘導(dǎo)的斑馬魚CY17氧化損傷模型，篩選復(fù)合物協(xié)同抗氧化作用最強(qiáng)的組合比例。

首先，目前高校和包括社區(qū)在內(nèi)的行政部門在推進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)過程中更多在扮演“獨(dú)角戲”的角色，教師和學(xué)生卻因?yàn)榧顧C(jī)制不足而參與度不高。其次，在調(diào)度各方創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)積極性上存在制度性壁壘，創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)生態(tài)鏈條上針對各方的協(xié)同機(jī)制不健全。最后，目前多以政策驅(qū)動等外在因素為主導(dǎo)，各方內(nèi)生動力不足，沒有形成適合創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的整體生態(tài)文化。

樣品處理：牛蒡多糖的制備參考并改進(jìn)Li等[15]的方法。以甲硝唑溶液（5 mmol/L）為溶劑，按照牛蒡多糖∶綠原酸（g∶g）為1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 的比例配制不同質(zhì)量濃度（1，10，50，100 μg/mL）的樣液。

斑馬魚氧化損傷模型的構(gòu)建：斑馬魚的養(yǎng)殖參考并改進(jìn)Westerfield 等[16]的方法，選擇成熟的斑馬魚CY17，按照雄魚∶雌魚為3∶2 或者2∶2 的比例放入繁殖缸內(nèi)，次日清晨收集受精卵，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后，將受精卵脫去外層卵膜，按照15 個胚胎/孔加入24 孔板中，分別在2 mL 甲硝唑溶液（5 mmol/L）、養(yǎng)殖水以及不同質(zhì)量濃度的樣液（1，10，50，100 μg/mL）中孵育。維生素C（200 μmol/L）為陽性對照。孵育24 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三卡因溶液將斑馬魚胚胎麻醉，然后利用顯微鏡觀察并拍照。利用Image Pro-Plus 軟件對斑馬魚的熒光細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，并用GraphPad Prism 8 軟件繪圖。根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)最多的樣品，確定復(fù)合物的最佳比例。

1.3.2 牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物的制備 首先將300 mg 多糖溶解于50 mL 去離子水中，溶解完全后，于10 000 r/min 下離心10 min，取多糖上清液。根據(jù)最佳比例，加入綠原酸水溶液?；旌暇鶆蚝螅?0 000 r/min 下離心10 min，上清液即為牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物分散液，冷凍干燥后得復(fù)合物粉末。

1.3.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 紫外光譜 使用全波長紫外-可見光分光光度計對樣品進(jìn)行全波長掃描，波長范圍為200～900 nm。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜 通過傅里葉變換紅外光譜分析樣品，在4 000～500 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析，掃描次數(shù)64 次，分辨率4 cm-1。

1.3.3.3 粒徑 采用激光納米粒度分析儀測量樣品的粒徑大小，設(shè)定散射角為90°，折光指數(shù)1.330，測定溫度25 ℃，保溫2.0 min[17]。

1.3.3.4 Zeta 電位 Zeta 電位樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，測量溫度25 ℃，折射率設(shè)置為1.330[18]。

1.3.3.5 形貌觀察 采用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀形態(tài)。將測試樣品粘在掃描電鏡觀察臺上，用濺射儀在真空條件下對樣品噴金。掃描電鏡圖像是在加速度電壓5 kV，放大倍數(shù)500 的條件下得到的[19]。

1.3.3.6 X-射線衍射分析 X-射線衍射儀配備Cu 靶陶瓷X 光管，加速電壓40 kV，電流40 mA，在2θ=5°～80°范圍內(nèi)，測定樣品的X 射線衍射強(qiáng)度[20]。

1.3.4 體內(nèi)抗氧化活性評價 為比較多糖、復(fù)合物、綠原酸在斑馬魚體內(nèi)的抗氧化酶水平，測定了三者的總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）活力。斑馬魚的養(yǎng)殖和孵育同1.3.1 節(jié)方法，孵育24 h，清洗幼魚3 次，吸干水分，收集并稱重。根據(jù)斑馬魚∶生理鹽水（g∶mL）=1∶9 的比例加入生理鹽水，破碎。之后，勻漿在3 000 r/min，4 ℃下離心20 min，取上清。分別按照T-SOD、CAT、MDA 試劑盒說明書方法測定上清中T-SOD、CAT 與MDA 活力。

1.3.5 體外抗氧化活性評價 研究了多糖、復(fù)合物和綠原酸的體外抗氧化能力，測定了三者的DPPH、ABTS+、OH-、O2-自由基清除率。DPPH 自由基清除率的測定參考Tan 等[21]的方法，ABTS+自由基清除率按Huang 等[22]方法測定，OH-自由基清除率的測定參考并改進(jìn)Sun 等[23]的方法，O2-自由基清除率的測定參考并改進(jìn)Wu 等[24]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為至少3 次測量的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。使用Origin 2018 和GraphPad Prism 8 軟件繪圖，并進(jìn)行差異性分析（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合物最佳組合比例的篩選

斑馬魚CY17是將熒光蛋白標(biāo)記在角質(zhì)細(xì)胞上，熒光顯微鏡下可觀察到斑馬魚的皮膚上顯示許多綠色的熒光亮斑點(diǎn)，其最外層魚皮對外部刺激非常敏感，添加甲硝唑后引起皮膚表層細(xì)胞凋亡，使熒光斑點(diǎn)消失。當(dāng)添加抗氧化物質(zhì)后，表皮細(xì)胞的損傷程度有所降低，熒光斑點(diǎn)數(shù)目會恢復(fù)，即熒光細(xì)胞數(shù)量增加[25]。圖1顯示了不同樣品處理后斑馬魚CY17的熒光細(xì)胞數(shù)。從圖中可以看出，空白組熒光細(xì)胞數(shù)約270 個，模型組顯著降低至約50 個，表明甲硝唑成功誘導(dǎo)斑馬魚表皮細(xì)胞減少，熒光細(xì)胞數(shù)量降低。與預(yù)期的一樣，樣品組的斑馬魚熒光細(xì)胞數(shù)較模型組均有不同程度的恢復(fù)，各樣品均表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。在低質(zhì)量濃度時（1，10 μg/mL）3 種不同比例的復(fù)合物熒光細(xì)胞數(shù)雖高于綠原酸，但稍低于多糖，表明低質(zhì)量濃度限制了復(fù)合物體內(nèi)協(xié)同抗氧化作用的發(fā)揮。在高質(zhì)量濃度下（50，100 μg/mL），當(dāng)牛蒡多糖與綠原酸的比例為1∶1 和1∶3 時，復(fù)合物熒光細(xì)胞數(shù)明顯多于2 種單體，表明2 種比例的復(fù)合物在高濃度條件下產(chǎn)生了增強(qiáng)的抗氧化效果。尤其當(dāng)復(fù)合物比例為1∶3 時，協(xié)同抗氧化效果更強(qiáng)，因此確定復(fù)合物的最佳比例為牛蒡多糖∶綠原酸（g∶g）=1∶3，后續(xù)用于結(jié)構(gòu)表征與抗氧化活性評價。

圖1 不同樣品處理后斑馬魚的皮膚熒光細(xì)胞數(shù)（n=15）Fig.1 The fluorescent cell count in zebrafish treated with different samples （n=15）

2.2 結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1 紫外光譜結(jié)果 牛蒡多糖、復(fù)合物與綠原酸的紫外光譜如圖2所示，可以觀察到牛蒡多糖在260～280 nm 波長范圍內(nèi)沒有吸收峰，證明牛蒡多糖中幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)。綠原酸屬于酚類物質(zhì)，含有苯環(huán)、雙鍵、羰基等不飽和結(jié)構(gòu)，在219 nm 和323 nm 波長處有紫外吸收峰[26]。復(fù)合物在波長219 nm 和323 nm 處出現(xiàn)了與綠原酸一致的吸收峰，表明復(fù)合過程中多糖與綠原酸沒有形成新的雙鍵。

圖2 多糖、復(fù)合物和綠原酸的紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectra of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.2 粒徑與Zeta 電位結(jié)果 多糖、復(fù)合物與綠原酸的粒徑大小如圖3a 所示。多糖的平均粒徑約為160～170 nm，而復(fù)合物與綠原酸的平均粒徑約為50～60 nm。顯然，復(fù)合物的粒徑顯著減小，說明多糖和綠原酸成功復(fù)合在一起使得粒徑減小。Zeta 電位可以度量顆粒在水系中相互吸引或相互排斥的強(qiáng)度，Zeta 電位的絕對值越高，體系越穩(wěn)定，粒子越不容易聚集[27]。如圖3b 所示，多糖、復(fù)合物和綠原酸的Zeta 電位分別為 （-15.23±0.47）mV，（-6.36±0.80）mV 和（-4.44±0.05）mV。可以看出牛蒡多糖與綠原酸均帶負(fù)電荷，可能由于它們含有豐富的羥基[28]，這有助于兩者之間形成氫鍵，且復(fù)合物的Zeta 電位絕對值高于綠原酸，表明復(fù)合物的形成可以提高綠原酸的穩(wěn)定性[29]。

圖3 多糖、復(fù)合物和綠原酸的粒徑圖（a）與Zeta 電位圖（b）Fig.3 Particle size（a），Zeta potentials（b） of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜結(jié)果 圖4表征了多糖、復(fù)合物與綠原酸在4 000～500 cm-1頻率范圍內(nèi)的紅外光譜。多糖在3 310 cm-1處出現(xiàn)羥基的伸縮振動峰，說明存在分子間氫鍵[30]。在2 930 cm-1和2 880 cm-1處出現(xiàn)-CH、-CH2和-CH3基團(tuán)的C-H伸縮振動峰[31]，1 030 cm-1處對應(yīng)吡喃糖環(huán)C-O-C的伸縮和變角振動峰[32]。綠原酸具有酚羥基（3 469，3 324 cm-1）、亞甲基（2 960 cm-1）、羰基（1 683 cm-1）、苯環(huán)（1 596，1 515 cm-1）的典型吸收峰[26]。復(fù)合物形成后，羥基峰發(fā)生明顯移動，移至3 674，3 391 cm-1處，這兩處分別對應(yīng)游離羥基峰與羥基形成氫鍵的締合峰，這表明多糖與綠原酸之間形成了氫鍵[33]。C-H 伸縮振動峰由2 930，2 880 cm-1分別移至2 984，2 898 cm-1，且吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，也表明多糖與綠原酸之間發(fā)生了強(qiáng)烈的氫鍵反應(yīng)[34]。在2 000～500 cm-1區(qū)域內(nèi)，復(fù)合物雖保留了多糖與綠原酸的某些特征吸收峰，但峰強(qiáng)度和位置有所改變，表明多糖與綠原酸產(chǎn)生了相互作用，而復(fù)合物在掃描范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)新的吸收峰，說明復(fù)合物的形成并沒有生成新的雙鍵[35]，這也符合紫外光譜的測定結(jié)果。因此推斷復(fù)合物的形成主要是氫鍵作用的結(jié)果。

圖4 多糖、復(fù)合物和綠原酸的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.4 X 射線衍射分析 如圖5所示，X-射線衍射圖譜顯示了復(fù)合物的結(jié)晶狀態(tài)。一般來講，晶體表現(xiàn)為尖而窄的特征峰，而非晶態(tài)物質(zhì)表現(xiàn)為寬而彌散的衍射峰[36]。多糖與綠原酸復(fù)合后在2θ 為6.27°和18.54°處出現(xiàn)了較寬的衍射峰，表明復(fù)合物具有一定的結(jié)晶特性，然而結(jié)晶度較低，以一種無定形狀態(tài)存在[37]。Liu 等[38]也觀察到了類似的結(jié)果，即將多酚接枝到多糖上導(dǎo)致了非晶態(tài)結(jié)構(gòu)的增加。

圖5 復(fù)合物的X-射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction pattern of complex

2.2.5 掃描電鏡分析 圖6顯示了500 倍數(shù)下多糖和復(fù)合物的掃描電鏡圖像。可以觀察到多糖結(jié)構(gòu)較為松散，具有許多孔隙，而多糖與綠原酸復(fù)合后孔隙消失，呈現(xiàn)出大小不一、棱角分明、質(zhì)地相對密實(shí)的無定型片狀結(jié)構(gòu)，這與XRD 分析得出的“復(fù)合物以一種無定形狀態(tài)存在” 的結(jié)論一致，也證實(shí)了多糖與綠原酸之間具有較強(qiáng)的相互作用力，成功地復(fù)合在一起。

圖6 多糖（a）與復(fù)合物（b）的掃描電鏡圖（500×）Fig.6 Scanning electron microscope images of polysaccharide （a） and complex （b） （500×）

2.3 體內(nèi)抗氧化酶活力測定

SOD 可以清除活性氧自由基，能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)換為氧氣和過氧化物，進(jìn)而對機(jī)體起到保護(hù)作用[39]。CAT 可以催化生物體內(nèi)的H2O2發(fā)生反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為分子氧和水，可保護(hù)機(jī)體免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷[40]。如圖7a 和7b 所示，T-SOD 活力與CAT 活力遵循一樣的趨勢。模型組的T-SOD活力、CAT 活力較空白組均顯著降低，表明甲硝唑?qū)C(jī)體造成了氧化損傷，而加入各樣品后，T-SOD與CAT 活力均表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)，表明機(jī)體的氧化損傷得到緩解。尤其是復(fù)合物的T-SOD、CAT 活力更高，表明其具有更強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化作用。MDA 反映了機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，含量越高，表明機(jī)體的氧化損傷越嚴(yán)重。圖7c 為MDA含量測定結(jié)果。與空白組相比，模型組的MDA 含量顯著升高，證實(shí)了甲硝唑?qū)Π唏R魚造成了嚴(yán)重的氧化損傷。樣品處理后，與預(yù)期結(jié)果一樣，復(fù)合物的3 種濃度的MDA 含量均呈極顯著下降趨勢，說明復(fù)合物降低氧化損傷的能力更強(qiáng)。上述數(shù)據(jù)證實(shí)牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物可以有效增加機(jī)體中T-SOD 與CAT 活力并降低MDA 含量，進(jìn)而抑制機(jī)體的氧化損傷。

圖7 不同樣品處理后的斑馬魚體內(nèi)T-SOD（a）、CAT（b）、MDA（c）活力Fig.7 T-SOD （a），CAT （b），MDA （c） activity of zebrafish exposed to different samples

2.4 體外抗氧化活性評價

圖8a 和8b 分別為各樣品對DPPH 和ABTS+自由基的清除能力?？梢杂^察到復(fù)合物和綠原酸對兩種自由基的清除率呈現(xiàn)相似的趨勢，復(fù)合物的最高清除率與綠原酸十分接近。經(jīng)過計算，復(fù)合物和綠原酸清除DPPH 自由基、ABTS+自由基的IC50分別為0.095，0.087 mg/mL 和0.35，0.28 mg/mL，表明復(fù)合物清除DPPH 和ABTS+自由基的能力與綠原酸相當(dāng)。而多糖的DPPH 自由基清除能力有所下降，約從10%增至70%；對ABTS+自由基的清除能力顯著降低，僅為10%左右。圖8c 和8d分別顯示了各樣品對OH-和O2-自由基的清除率。復(fù)合物對兩種自由基的清除率均稍低于綠原酸而明顯強(qiáng)于多糖。經(jīng)計算，復(fù)合物和綠原酸清除OH-自由基、O2-自由基的IC50分別為1.06，0.86 mg/mL和0.73，0.54 mg/mL，表明復(fù)合物清除OH-和O2-自由基的能力稍弱于綠原酸。而多糖對兩種自由基的清除能力均較低，清除率僅為15%～20%左右，且與濃度無明顯關(guān)聯(lián)。綜上所述，復(fù)合物的體外抗氧化能力顯著優(yōu)于多糖，且與綠原酸較為接近。

圖8 不同樣品的DPPH（a）、ABTS+（b）、OH-（c）、O2-（d）自由基清除率Fig.8 DPPH （a）、ABTS+ （b）、OH- （c）、O2- （d） free radical clearance rate of different samples

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建斑馬魚氧化損傷模型，篩選了體內(nèi)協(xié)同抗氧化作用最佳的牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物比例，制備了牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及體內(nèi)、外抗氧化活性評價。斑馬魚的氧化損傷模型結(jié)果表明，牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物發(fā)揮協(xié)同抗氧化的最佳比例為多糖∶綠原酸=1∶3。該比例下的復(fù)合物平均粒徑約為50～60 nm，Zeta 電位為（-6.36±0.80）mV。紅外光譜和掃描電鏡結(jié)果顯示多糖與綠原酸之間形成了質(zhì)地緊密的無定形片狀結(jié)構(gòu)，氫鍵可能是復(fù)合物形成的主要作用力。此外，復(fù)合物可以顯著提高機(jī)體的T-SOD 活力和CAT 活力，降低MDA 含量，有效抑制機(jī)體的氧化損傷，且具有良好的清除DPPH、ABTS+、OH-、O2-自由基的能力。以上研究表明牛蒡多糖-綠原酸復(fù)合物可以作為一種新型抗氧化劑協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用，為抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供理論支撐和技術(shù)支持。