王 璐，陸勝民，王 璐，鄭美瑜，王陽光*

（1 浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院 浙江 舟山 316022 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所 浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室 杭州 310021）

柑橘黃酮包括黃烷酮、黃酮和花色素苷等，其中橙皮苷、柚皮苷等黃烷酮最為豐富[1]。橙皮素是橙皮素的糖苷配基，是一種二氫黃酮類化合物，具有抗氧化，消除自由基，調節(jié)心血管系統(tǒng)的功能，在保護神經(jīng)系統(tǒng)，抗細菌及微生物，抗癌及基因毒性，抗過敏及皮炎，以及提高其它藥物生物利用度等方面都有一定的效果[2-3]。然而，橙皮素等柑橘黃酮大多存在水溶性差的特點，在生物體內利用率低，限制了其在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)中的應用。選擇合適的增溶輔料和增溶方法以提高橙皮素的溶解度非常重要。

辛烯基琥珀酸淀粉酯 （Octenyl succinic anhydride modified starches，OSAS）是辛烯基琥珀酸酐（OSA）與淀粉酯化反應后得到的一種兩親性化合物，具有典型的親水主干-疏水支鏈的結構[4]。OSAS 分子質量大，可在油-水界面處形成一層堅韌不易破裂的液膜，降低界面張力，可穩(wěn)定水包油型的乳濁液[5]。同時，具有優(yōu)良的自由流動疏水性，防止淀粉分子鏈的相互凝聚[6]。經(jīng)OSA 酯化后的淀粉黏度增大，可作為增稠劑使用，不存在配伍禁忌且能與其它表面活性劑協(xié)同增效，這些特性使得OSAS 在食品、化妝品、紡織、造紙、醫(yī)藥等工業(yè)化生產(chǎn)中應用廣泛。

Shogren 等[7]研究表明，OSAS 淀粉顆粒橫截面上OSA 基團分布均勻，溶于水時多數(shù)支鏈淀粉分子帶負電荷，而經(jīng)酶處理部分去分枝后，相應的鏈更多地呈中性，提示OSA 在分枝水平的取代是不均勻的。Klaochanpong 等[8]比較了不同濃度的OSA與糯米和糯馬鈴薯淀粉的粒狀和脫支淀粉的反應，發(fā)現(xiàn)脫支淀粉的反應效率高于粒狀淀粉，表明OSA 難以進入淀粉顆粒結晶區(qū)域，因此在分散的淀粉鏈上更能有效地發(fā)生酯化反應。Li 等[9]制備了OSA 淀粉并用于穩(wěn)定乳液，結果表明：隨著OSA改性淀粉取代度的增加，乳液的穩(wěn)定性和對姜黃素的包封效率提高。淀粉中所含直鏈、支鏈含量的高、低會對OSA 改性淀粉的取代度產(chǎn)生影響，同時OSA 改性淀粉的兩親性會隨取代度的變化而發(fā)生改變。

本文采用水相法制備不同直鏈/支鏈比的OSAS，通過物性分析和結構表征，探究不同直鏈/支鏈比的OSAS 與其理化性質的關系及其對橙皮素溶解度的影響，闡明淀粉鏈結構變化影響OSAS對難溶性黃烷酮溶解性的規(guī)律，為OSAS 改善柑橘黃酮溶解性，擴大應用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4 種直鏈、支鏈含量玉米淀粉，上海耐今實業(yè)有限公司；辛烯基琥珀酸酐（OSA）（純度≥99.5%），山東濟南浩化實業(yè)有限責任公司；直鏈淀粉標準品，美國Sigma 公司；支鏈淀粉標準品，上海源葉生物科技有限公司；橙皮素 （純度≥98%），西安天本生物工程有限公司；甲醇（色譜級）、乙酸，上海國藥集團化學試劑有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

UV-1800 型紫外分光光度計、LC-2030C 高效液相色譜儀，日本島津公司；LXJ-ⅡB 型離心機，上海安亭科學儀器廠；XMTD-8222 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；85-2 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市江南儀器廠；Regulus 8100 超高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；VERTEX 70 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同直鏈、支鏈含量淀粉的直鏈/支鏈比的測定 雙波長的選擇及直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的測定，參考金紅玉等[10]的方法。

1.2.2 OSAS 的制備 OSAS 的制備方法參考鐘敏賢[11]、張紅利等[12]的方法。

1.2.3 OSA 取代度的測定 OSA 取代度的測定方法參考張紅利等[12]、Klaochanpong 等[8]的方法。

1.2.4 溶解度和膨潤力的測定 溶解度和膨潤力的測定方法參考江美都等[13]的方法。

1.2.5 凝沉性的測定 取50 mL 質量濃度為1 g/100 mL 的淀粉糊放入刻度試管中，在25～30 ℃下靜置，每隔24 h 記錄上層清液或下方沉降物的體積，沉降物所占的體積即為沉降積，以毫升表示。另外，考察清液體積占糊總容積的百分比隨靜置時間的變化情況，兩者均反映淀粉糊的凝沉性質。

1.2.6 透明度的測定 透明度的測定方法參考李鑫等[14]的方法。

1.2.7 掃描電子顯微鏡分析 將制備得到的不同直鏈/支鏈比的OSAS 樣品均勻地鋪撒在附有膠性物質的樣品臺上，鍍金處理后，在掃描電子顯微鏡樣品室中，對樣品進行觀察，并選擇在放大800 倍和4 000 倍條件下，對樣品形貌進行拍照。

1.2.8 橙皮素-OSAS 飽和水體系聚集體的制備分別稱取適量4 種直鏈/支鏈比的OSAS，于純凈水中配制成質量濃度為4 g/100 mL 的淀粉乳，室溫下攪拌均勻使之充分分散。加入同等質量的橙皮素，在25 ℃條件下磁力攪拌4 h，4 000 r/min 離心20 min 后取上清液。

另制備一份未添加OSAS、在相同體積純凈水中添加上述同等質量橙皮素的溶液，在相同條件下磁力攪拌4 h，4 000 r/min 離心20 min 后取上清液。

1.2.9 橙皮素的測定 精準稱取橙皮素標準品0.1 g，用甲醇（色譜純）溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL 的標準儲備液。取標準儲備液用甲醇分別稀釋，配成質量濃度為20～450 μg/mL 的梯度標準工作液，使用HPLC 測定吸光度，制備標準曲線，擬合得橙皮素線性回歸方程為：y=24889.69146x+77619.0379，R2=0.99978。

高效液相色譜（HPLC）測定條件[15]為：色譜柱為Shim-pack GIST C18（150 mm×4.6 mm×5 μm），以0.2%乙酸水（A）和甲醇（B）為流動相，A∶B=45∶55，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測波長287 nm。

取橙皮素-OSAS 水體系聚集體溶液和橙皮素水溶液經(jīng)0.45 μm 過濾，用甲醇適當稀釋后進行測定，計算橙皮素濃度。

1.2.10 FT-IR 分析 采用KBr 壓片法，波長掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，F(xiàn)T-IR 分析不同直鏈/支鏈比OSAS 粉末、未酯化的不同直鏈/支鏈比玉米淀粉、冷凍干燥后的橙皮素-OSAS 聚集體樣品。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組試驗均重復3 次，采用SPSS 25 進行數(shù)據(jù)顯著性差異分析（P＜0.05），采用Origin 2020 b和Excel 2012 作圖。

2 結果與分析

2.1 雙波長的確定

用UV-1800 分光光度計對淀粉液在400～800 nm 波長范圍內進行掃描，得到吸收光譜（圖1），結果顯示直鏈淀粉測定波長為499 nm，參比波長為586 nm；支鏈淀粉測定波長為540 nm，參比波長為725 nm。

圖1 作圖法確定直鏈淀粉/支鏈淀粉檢測波長Fig.1 Graphical construction of detection wavelength for amylose and amylopectin

2.2 淀粉樣品的直鏈/支鏈比

以上述所選的雙波長分別測定不同濃度的直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸光值，得到直鏈淀粉含量的回歸方程y=2.81083x-0.01586（R2=0.99255），在0～0.156 mg/mL 范圍內符合比耳定律；支鏈淀粉含量的回歸方程為y=1.52328x-0.00185 （R2=0.99762），在0～0.200 mg/mL 范圍內符合比耳定律。

分別測定4 種玉米淀粉樣品在499，586，540，725 nm 波長下的吸光度值。根據(jù)雙波長分光光度法的回歸方程計算樣品1～4 中直鏈淀粉和支鏈淀粉質量分數(shù)，結果見表1。由表可知3 號樣品中所含直鏈淀粉最高，2 號和4 號樣品中含有較高的支鏈淀粉，而1 號樣品中所含的直鏈淀粉和支鏈淀粉均不高，推測其中可能含有較多的直鏈淀粉與支鏈淀粉的分子中間體、短鏈葡聚糖等[16]。

表1 4 種玉米淀粉樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉的質量分數(shù)Table 1 Contents of amylose and amylopectin in four corn starch samples

2.3 不同直鏈/支鏈比OSAS 的OSA 取代度

OSA 取代度（Degree of substitution，DS）是淀粉分子中每個基本脫水葡萄糖單元（AGU）上含有的OSA 基團的平均數(shù)量。淀粉分子經(jīng)與OSA 酯化反應后形成兩親性化合物，它既有親水性基團羧酸基，也有疏水性基團辛烯基長碳鏈。因此，OSA基團的取代程度決定了淀粉的包埋性和乳化性[17]。如表2所示，4 種直鏈/支鏈比OSAS 的DS 值均小于0.02，符合美國食品藥品監(jiān)管局（FDA）對食品中OSAS 添加標準的要求。同時各樣品的DS 值由高到低依次為3-OSAS＞1-OSAS＞2-OSAS＞4-OSAS，說明淀粉的直鏈/支鏈比越大，OSA 基團的取代程度越高，可依此結果預測這4 種OSA 淀粉對橙皮素的增溶效果。

表2 不同直鏈/支鏈比OSAS 的取代度Table 2 DS values of OSAS with different straight/branched chain ratios

2.4 不同直鏈/支鏈比OSAS 的溶解度和膨潤力

如圖2所示，溶解度由高到低依次為1-OSAS＞4-OSAS＞2-OSAS＞3-OSAS，其中3 號樣品含直鏈淀粉較高，較難糊化，因而溶解度最低。1-OSAS、2-OSAS、4-OSAS 溶解度相差不大，均有一定程度的糊化。淀粉糊化過程中，微晶束結構不斷松動，使淀粉團粒分解，游離出的直鏈淀粉溶于水，使淀粉的溶解度增加[18]。

圖2中3-OSAS 樣品的膨潤力小于1-OSAS、2-OSAS、4-OSAS 淀粉，這是由于其含有的支鏈淀粉最少。淀粉的膨潤力大小主要由支鏈淀粉含量決定，支鏈淀粉含量越多，膨潤力越大[18]。

2.5 不同直鏈/支鏈比OSAS 的凝沉性

淀粉糊的沉降積反映了淀粉糊化后重新聚集成凝膠的能力。由圖2可知，3-OSAS 的沉降時間早于1-OSAS、2-OSAS 和4-OSAS，而最終的沉降積3-OSAS 小于1-OSAS、2-OSAS 和4-OSAS。淀粉顆粒在加熱過程中吸水膨脹，發(fā)生糊化，形成緊密結構且不溶于水，從而使淀粉糊出現(xiàn)凝沉現(xiàn)象。淀粉糊的沉降與直鏈淀粉含量有關，直鏈淀粉含量越高，越容易發(fā)生沉降[19]。

2.6 不同直鏈/支鏈比OSAS 的透明度

2-OSAS 和4-OSAS 樣品具有較高的透明度，而3-OSAS 樣品的透明度最低（圖2）。2-OSAS 和4-OSAS 樣品具有較高的透明度主要與其中含有較多的支鏈淀粉有關；3-OSAS 樣品含有較多的直鏈淀粉，在相同處理條件下未完全糊化，呈懸濁液，因而透明度低。淀粉中支鏈淀粉含量越多，分子間締合作用越小，越不易發(fā)生分子間聚合，因而透明度越高[20]。

圖2 不同直鏈/直鏈比OSAS 的理化性質Fig.2 Physicochemical properties of OSAS with different straight chain/branched chain ratios

2.7 不同直鏈/支鏈比OSAS 的顯微結構分析

如圖3-1a 所示，在較大的顆粒之間夾雜著較多小顆粒，這與前文試驗1-OSAS 樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量均較低的結果相對應，圖中的小顆粒推測可能為短鏈葡聚糖等小分子。酯化改性后的淀粉顆粒表面不光滑，可能是由淀粉分子上酯基的引入所造成的，表面顯示點狀腐蝕，與文獻報道結果一致[21-22]。2-OSAS 樣品中含有直鏈淀粉和較高的支鏈淀粉，圖3-2a 中既有多面體也有卵形。圖3-2b 中部分卵形顆粒呈畸形，可能是淀粉與OSA 反應所致。圖3-3a 中有較多棒狀顆粒，圖3-3b 中的棒狀顆粒減少，推測棒狀顆粒可能為直鏈淀粉，經(jīng)與OSA 酯化反應后變化為橢圓形。圖3-4a 中的顆粒多呈多角形，表面粗糙，而與OSA 酯化反應后形成的顆粒形狀更為圓潤，推測可能為OSA 基團對淀粉的修飾作用。4 種淀粉改性后形貌基本保持不變，未發(fā)現(xiàn)明顯裂痕和破損，說明OSA 酯化反應在淀粉的無定形區(qū)進行，未破壞淀粉的結晶區(qū)[23]。

圖3 不同直鏈/支鏈比玉米淀粉OSA 酯化反應前、后的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.3 Scanning electron micrographs of corn starches with different straight/branched chain ratios before and after esterification by OSA

2.8 不同直鏈/支鏈比OSAS 對橙皮素溶解度的影響

不同直鏈/直鏈比OSAS-橙皮素聚集體中橙皮素含量如圖4所示。1-OSAS、2-OSAS、3-OSAS和4-OSAS 分別對橙皮素的溶解度提高了3.7，5.2，5.4，2.3 倍，其中對橙皮素增溶明顯的3-OSAS樣品所含直鏈淀粉最多，取代度最高，OSAS 對橙皮素的增溶效果可能與直鏈淀粉含量和高取代度有關。

圖4 不同直鏈/支鏈比OSAS 與橙皮素水體系中的橙皮素含量Fig.4 Hesperetin content in different straight chain/branched chain ratio of aqueous systems OSAS-hesperetin

2.9 不同直鏈/支鏈比玉米淀粉、OSAS 及OSAS-橙皮素聚集體的FT-IR 光譜

由圖5可知，在特征光譜的區(qū)域里，各淀粉在3 500～3 400 cm-1區(qū)域內有一較大吸收峰，是由O-H 的伸縮振動所產(chǎn)生；在2 930 cm-1附近的特征峰是由C-H 伸縮振動所產(chǎn)生。1 157，1 015，930 cm-1這幾處強烈吸收峰是C-O 伸縮振動所產(chǎn)生。出現(xiàn)在1 650 cm-1特征峰值可能與淀粉分子中的結合水有關。與原淀粉相比，OSAS 在1 724 cm-1處有一個新的吸收峰，此特征峰為羰基的伸縮振動峰，同時在1 570 cm-1處附近出現(xiàn)新的吸收峰可能是形成的羧酸鹽的不對稱伸縮振動吸收峰[11]。除了這2 個新的吸收峰以外，OSAS 的其余各峰與原淀粉相差不大，證明淀粉OSA 酯化后未引入其它雜質。譜圖顯示不同直鏈/支鏈比OSAS 的吸收峰無明顯差異。

圖5 不同直鏈/支鏈比玉米淀粉OSA 酯化前、后FT-IR 光譜的變化Fig.5 Changes of FT-IR spectra of corn starch with different straight chain/branched chain ratios before and after OSA esterification

圖6為不同直鏈/支鏈比OSAS-橙皮素聚集體的紅外譜圖，橙皮素在1 670～1 560，1 465～1 230，900～800 cm-1區(qū)域內有吸收峰，這是由苯環(huán)C=C 伸縮振動、苯環(huán)與酚羥基/甲氧基之間的C-O伸縮振動以及C-H 的彎曲振動所引起[24]。與橙皮素單體譜圖相比，聚集體中部分橙皮素特征譜帶消失，3 117 cm-1處橙皮素的-OH 中的氫鍵被破壞，橙皮素與OSAS 在2 900～3 000 cm-1處形成了新的氫鍵，且聚集體譜圖中并未出現(xiàn)新的官能團吸收峰，表明沒有生成新的化學鍵。橙皮素-OSAS聚集體譜圖中1 517 cm-1處的吸收峰相較于橙皮素出現(xiàn)偏離，可能是由于橙皮素與OSAS 形成的氫鍵所影響。氫鍵的形成會使電子云密度降低，從而使伸縮振動頻率降低，吸收峰向低波數(shù)移動[25]。

圖6 不同直鏈/支鏈比OSAS-橙皮素聚集體的紅外譜圖Fig.6 FT-IR spectra of OSAS-hesperetin aggregates with different straight chain/branched chain ratios

3 結論

采用不同直鏈、支鏈比例的玉米淀粉制備得到的辛烯基琥珀酸淀粉酯（OSAS）的取代度測定結果表明，直鏈淀粉含量占比高的淀粉與辛烯基琥珀酸酐（OSA）反應的取代度更高，與OSA 的反應效率更高。理化性質測定結果顯示，OSAS 中所含支鏈淀粉含量越高，膨潤力越大且透明度越高；OSAS 中所含直鏈淀粉量越高，越容易發(fā)生沉降。結構表征結果表明，OSA 主要在淀粉顆粒表面發(fā)生作用，即反應只在淀粉的無定形區(qū)進行，淀粉的結晶區(qū)未發(fā)生改變。不同直鏈/支鏈比OSAS 對橙皮素的增溶結果顯示，直鏈/支鏈比高的OSAS 增溶效果更好，原因可能是OSA 酯化主要發(fā)生在無定形區(qū)，無定形區(qū)主要由直鏈淀粉構成，OSA 更容易接枝在直鏈淀粉上，所形成的OSAS 具有更好的兩親性。相較于橙皮素在水中的溶解度，高直鏈OSAS-橙皮素聚集體溶液中橙皮素溶解度增加了5.4 倍。