李元鵬，張英杰，朱志奇，呂云飛，張京偉，郭文姣，孫紀霞*

(1 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東煙臺 265500；2 煙臺大學 生命科學學院，山東煙臺 264005；3 萊州市宏順梅花種植科技有限公司，山東萊州 261400；4 煙臺市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊，山東煙臺 264000)

月季(RosachinensisJacq.)是中國十大名花之一，在國內(nèi)廣泛栽植。花色是月季的重要觀賞性狀，同時也能吸引昆蟲授粉，在植物體繁衍后代方面有重要作用[1-2]?；ò觐伾芑ㄉ辗N類、含量、花瓣結(jié)構(gòu)、pH值及金屬絡合物形態(tài)等共同決定，而類黃酮類花色苷可以決定產(chǎn)生各種顏色，對花色具有重要影響[3-6]。不同光照強度會影響花瓣花色苷的合成[7]，進而影響花瓣著色。月季被大量用于不同光照條件的園林環(huán)境中，生產(chǎn)中常用不同密度遮蔭網(wǎng)遮蔭處理，目前遮蔭對花色影響的研究見于牡丹[8]、長春花[9]、芍藥[10]和郁金香[11]等植物，對遮蔭處理下不同色系月季花色與花色苷含量之間的相關(guān)性研究較少。因此，研究遮蔭條件下不同色系月季在各個發(fā)育階段花色苷與花色間的動態(tài)關(guān)系，對月季合理、高效栽培及花色定向育種具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

選取溫室內(nèi)的紅色月季‘梅朗口紅’(Rouge Meilland)、黃色月季‘朝圣者’(The Pilgrim)、藍紫色月季‘微藍’(Kinda Blue)，分別置于正常光照(CK，2.82×109lux)、遮蔭25%(SⅠ，1.18×109lux)、遮蔭50%(SⅡ，3.97×108lux)環(huán)境中，每個處理下選取6株無病蟲害、生長良好的植株，共計18盆，其他培養(yǎng)條件相同。如圖1所示，K、W、C分別代表‘梅朗口紅’、‘微藍’、‘朝圣者’,于小蕾期(W1、C1、K1)、大蕾期(W2、C2、K2)、初開期(W3、C3、K3)、半開期(W4、C4、K4)、盛花期(W5、C5、K5)、末花期(W6、C6、K6)采摘生長發(fā)育良好的花朵，將花瓣置于65 ℃烘箱中，干燥30 h，待花瓣完全干燥后研成粉末，于4 ℃干燥、冷藏備用。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 花色隨機選取不同遮蔭處理下各個時期花朵外輪的花瓣，利用色差儀CR-10(柯尼卡,日本)在花瓣內(nèi)側(cè)中下部位測定花瓣的L*(亮度)、a*(綠-紅)、b*(藍-黃)、C*(飽和度)等CIE值[12]，每組重復3次，取平均值[13]。

1.2.2 花瓣葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮含量各種色素提取液的制備，以及葉綠素、類胡羅卜素、類黃酮的特征峰的檢測、測定參考李元鵬的方法[14]。

1.2.3 花瓣總類黃酮含量(1)供試品溶液的制備。取色素提取液100 μL，加入蒸餾水800 μL，再加入5% NaNO2，混勻靜置5 min；加入60 μL濃度為10% AlCl3，混勻靜置10 min；加入400 μL 1 mol/L的NaOH，最后用蒸餾水定容至2 mL。(2)繪制標準曲線。使用蘆丁(UV≥98%)的標準品配置成15個梯度10～80 μg/mL的標準液，以水為空白對照，以濃度C(μg/mL)為自變量(x)、吸光度A510(Abs)為因變量(y)，制作蘆丁標準曲線。得到回歸線方程y= 0.021 7x-0.004 2，R2=0.999 6,證明標準曲線在10～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)吸光值與濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。(3)總類黃酮含量測定。用島津UV3100型紫外可見分光光度計測定供試品溶液在510 nm處的吸光值[15]，根據(jù)標準曲線計算不同時期總類黃酮含量。

1.2.4 花瓣總花色苷含量采用pH示差法測定總花色苷含量，色素提取參考1.2.3中的方法，其他操作參考Jungmi的方法[16]。計算公式為，總花色苷含量(mg/100g)=A×VF×MW×1 000/(ε×C)。其中，A=(A520nm/pH1.0-A700nm/pH1.0)-(A520nm/pH4.5-A700nm/pH4.5)，VF為稀釋倍數(shù)；MW=449.2；ε=296 009(摩爾消光系數(shù))；C為提取液濃度。每組每處理測量3次，取平均值。

1.2.5 花瓣pH選取各組不同生長期生長良好的花瓣鮮樣各50 g，研碎花瓣、擠出汁液，用pH計讀數(shù)，每組重復3次取平均值即為該品種花瓣pH。

1.3 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)整理及標準曲線制作用Excel 2018，統(tǒng)計學分析用SPSS 17.0，Origin制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季花瓣花色苷種類初步分析

由圖2可知，各品種月季花瓣色素提取液在葉綠素特征峰662 nm和644 nm處無明顯吸收峰(圖2，A)，其提取液在類胡蘿卜素特征峰440 nm和470 nm處也無吸收峰(圖2，B)，即證明3個月季品種花瓣內(nèi)無葉綠素，也不含類胡蘿卜素。月季品種‘梅朗口紅’和‘微藍’的色素提取液在500～600 nm間有吸收峰(圖2，C)，說明其花瓣含花色苷，而品種‘朝圣者’在特征峰范圍內(nèi)無明顯吸收峰，說明其花瓣不含花色苷。

K、W、C分別代表月季品種‘梅朗口紅’、‘微藍’、‘朝圣者’，1～6分別代表小蕾期、大蕾期、初開期、半開期、盛花期和末花期，下同圖1 3種參試月季不同發(fā)育時期花朵K, W, and C represent rose cultivar ‘Rouge Meilland’, ‘Kinda Blue’ and ‘The Pilgrim’, respectively. 1-6 represent small bud stage,big bud stage, initial opening stage, half opening stage, full flowering stage and final flowering stage, respectively. The same as belowFig.1 The flower of three Chinese roses in different developmental stages

曲線上的數(shù)字1-5分別代表提取液的吸收峰圖2 各月季品種花瓣葉綠素(A)、類胡蘿卜素(B)、花色苷(C)提取液紫外光譜圖The numbers (1-5) on the curve represent the absorption peaks of the extract respectivelyFig.2 The UV spectra of chlorophyll (A), carotenoid (B) and anthocyanin (C) extracts from flowers of different China rose varieties

2.2 遮蔭處理對各月季品種不同時期花色(CIE值)的影響

2.2.1 L*(亮度)值圖3顯示，藍紫色月季品種‘微藍’L*值除W1時期外，兩種遮蔭處理與對照組(CK)差異均達到顯著水平(P<0.05)，且以SⅡ處理W4時期的L*值最大，是同期CK組的1.27倍；與CK組相比，各遮蔭處理L*值的總體變化趨勢一致，但遮蔭程度越高、L*值的波動就越大；即遮蔭處理對該品種L*值影響顯著，隨著遮蔭強度的提高，花瓣亮度增加，并在始花期達到最大。對于紅色系月季品種‘梅朗口紅’，除SⅠ處理的K3和K6時期外，其他時期遮蔭處理L*值均與CK組差異顯著(P<0.05)；除在K1時期外，其他各發(fā)育時期遮蔭處理L*與CK組差值較小，且不同遮蔭處理下L*的變化趨勢明顯不同；說明遮蔭會使該品種月季亮度產(chǎn)生明顯波動，但亮度變化量不大。黃色品種月季‘朝圣者’的L*值與CK組相比，在SⅠ處理下差異均達到顯著水平(P<0.05)，而SⅡ條件下僅在C2、C5時期差異顯著(P<0.05)，且不同處理下各時期間波動較小、各時期內(nèi)的極值差不大，說明只有在一定的遮蔭強度內(nèi)，該品種花瓣亮度才會受到光照的顯著影響。

2.2.2 a*(綠-紅)值‘微藍’的a*值，除SⅡ處理下的W2、W3時期外，其他各時期遮蔭處理與CK組的差異均達到顯著水平(P<0.05)，并在SⅠ處理W2時期達到最大，分別是同期CK、SⅡ組的1.50和1.92倍，說明適度遮蔭會促進該品種花色變紅，而過度遮蔭反而會產(chǎn)生抑制作用。除K1、K2、K4時期外，‘梅朗口紅’的a*值受遮蔭的影響不甚顯著；遮蔭處理下a*值的變換趨勢與CK組一致，最大值均出現(xiàn)在K4時期，且相差不大，即遮蔭對該品種月季綠-紅度的影響較小?！フ摺腶*值與CK組相比，在除SⅠ處理C1期、SⅡ處理C4期外，其他各時期內(nèi)a*值的差異均達到顯著水平(P<0.05)，與其他品種不同的是，遮蔭處理導致該品種的a*值下降，并以SⅠ處理的C3時期降幅最大，是對照組的0.43倍，說明遮蔭會使該品種花瓣的紅度下降。

2.2.3 b*(藍-黃)值‘微藍’的b*值與CK組相比，在兩種遮蔭處理各時期均差異顯著(P<0.05)，且在遮蔭處理下劇烈波動、改變變化趨勢并在K3時期就達到最小值，是同期CK組的1.58倍，說明遮蔭會使該品種月季提早變藍且使藍度提高?！防士诩t’各時期a*值波動較大，且遮蔭組變化趨勢與對照組基本一致，但遮蔭處理下的最大值較高，除K6時期外，遮蔭處理與CK組差異顯著(P<0.05)，即遮蔭不會改變該品種花色的變化趨勢，但會使花色更趨于黃色。與CK組相比，‘朝圣者’各時期的b*值在遮蔭處理下變化多為不顯著(P>0.05)，SⅠ處理下b*值的變化趨勢與CK組相同，但始終處于CK組數(shù)值之下，而SⅡ處理與CK組的變化趨勢差異較大，所以遮蔭使該品種黃度下降，但影響不甚顯著，而過度遮蔭會改變其黃度變化趨勢。

2.2.4 C*(飽和度)值品種‘微藍’的C*值與CK組相比， 除W1時期外，兩種遮蔭處理變化均達到顯著水平(P<0.05)，且明顯改變了C*值的變化趨勢，特別是SⅡ處理下出現(xiàn)了劇烈波動，且在W5時期達到最大值，是對照組的3.74倍，說明遮蔭對該品種飽和度高低和變化趨勢的影響顯著，且遮蔭強度越高效果越明顯。除K3期外，‘梅朗口紅’各時期內(nèi)的C*值在對照組與遮蔭處理組間均存在顯著差異(P<0.05)，且SⅡ處理改變了C*值的變化趨勢，同時使C*值下降，說明遮蔭降低了該品種花瓣的飽和度，高強度遮蔭還會改變飽和度的變化趨勢?！フ摺腃*值與CK組相比，在除C1時期外，遮蔭處理的各時期內(nèi)均存在顯著差異(P<0.05)，且遮蔭改變了C*值的變化趨勢，同時遮蔭處理下的C*值始終低于對照組，并以SⅠ處理時下降最明顯，其最大值僅是CK組的0.57倍，即遮蔭會使該品種花瓣飽和度下降、變化趨勢改變，而過度遮蔭會使此效應減弱。

2.3 遮蔭處理對各月季品種不同時期花瓣生理生化指標的影響

2.3.1 pH 值由圖4可見，‘微藍’花瓣pH在SⅠ處理的W5期高于同期CK，其余時期均不同程度地低于CK組，且除W2和W4時期外，各時期差異均達到顯著水平(P<0.05)，SⅠ組最高值與CK組pH最高值相差4.6%，波動較大；在SⅡ處理組的W1、W5、W6期高于同期CK組，其余時期均不同程度地低于CK組，且各時期差異均達到顯著水平(P<0.05)。‘梅朗口紅’花瓣pH在SⅠ處理的各發(fā)育時期與CK組變化趨勢相同，均為先升后降，最大值和最小值均在K2期，且除K4、K5時期外各時期差異均達到顯著水平，但總體上CK組pH相對較高；花瓣pH在SⅡ組波動較大，與CK組峰值差較大；即遮蔭會顯著影響‘梅朗口紅’花瓣pH，特別是SⅡ條件下會使pH顯著升高(P<0.05)，并在K2期表現(xiàn)最明顯?！フ摺ò阷H值在3組處理下隨著發(fā)育期均呈先升后降再升的變化趨勢，與CK組相比，最大值為SⅡ組C6期，分別為CK、SⅠ組的1.04、1.05倍，且除C3、C3時期外，各個時期pH的變化差異顯著(P<0.05)。說明適當遮蔭可以引起品種‘朝圣者’花瓣pH顯著提高。

不同小寫字母表示同一處理不同發(fā)育時期間在0.05水平差異顯著(P≤0.05)圖4 不同遮蔭條件下月季花瓣生理生化指標變化統(tǒng)計圖The different lowercase letters within the same treatment indicate significant differences among different developmental stages at 0.05 level (P≤0.05)Fig.4 The statistical graph of physiological and biochemical indexes of China rose petals under different shade conditions

2.3.2 類黃酮含量‘微藍’花瓣類黃酮含量與CK組相比，在SⅠ、SⅡ處理不同發(fā)育期的變化趨勢相同，均出現(xiàn)了2個峰，同時各組間極值差相差不大，但各處理峰值出現(xiàn)時期各不相同，且各時期遮蔭處理組含量與CK組差異顯著(P<0.05)；花瓣類黃酮積累量最多的是SⅡ組；即適當遮蔭可以引起該品種月季類黃酮含量的波動，強遮蔭會提高花瓣類黃酮的積累量?！防士诩t’花瓣類黃酮含量在不同處理下隨發(fā)育期變化趨勢差異較大，CK和SⅠ組變化趨勢相同，且各時期內(nèi)各處理間含量差異均達到顯著水平(P<0.05)；SⅠ條件下類黃酮含量波動最大，其極值相差6.15倍；即強遮蔭條件下可以提高其類黃酮積累量。不同處理下‘朝圣者’花瓣類黃酮含量變換趨勢總體相似，雖有輕微波動，但整體上呈下降趨勢，并以SⅠ組類黃酮含量波動最大、積累量最多。說明適當遮蔭可以引起‘朝圣者’花瓣類黃酮含量波動、提高其含量。

2.3.3 花色苷含量藍紫色品種‘微藍’花瓣花色苷含量在CK、SⅠ條件下隨著發(fā)育時期總體上呈先上升、后下降的變化趨勢，各階段含量產(chǎn)生了顯著差異(P<0.05)；遮蔭處理導致花色苷含量峰值期和極值差不同，在SⅡ處理下花色苷含量波動較小、積累量最少。與CK組相比，不同遮蔭處理下‘梅朗口紅’花瓣花青苷含量均在K4期達到最大值，并以SⅡ組含量最高，變化趨勢為先上升后下降；各階段花青苷含量在處理間均差異顯著(P<0.05)，說明遮蔭條件下該品種月季花青苷含量波動較大且在K3-K4時期花青苷大量累積。

2.4 月季花色CIE參數(shù)與生理生化指標相關(guān)性分析

由表1可知，在CK條件下，藍紫色品種‘微藍’花瓣的L*與a*，以及a*與b*、C*之間均呈顯著負相關(guān)，L*與b*、C*，以及b*與C*之間均呈顯著正相關(guān)，即隨著‘微藍’顏色變紅，其亮度會下降，而隨著其藍度的增加，亮度和飽和度會提高，觀賞品質(zhì)也會提高。在SⅠ遮蔭條件下，‘微藍’花瓣AN與pH，以及L*與a*之間有顯著負相關(guān)，F(xiàn)L與C*之間顯著正相關(guān)，說明隨著‘微藍’花瓣花色苷的積累、花瓣顏色會加深，而花瓣pH和亮度會下降。在SⅡ遮蔭條件下，‘微藍’花瓣L*與a*之間顯著負相關(guān)，pH與b*之間顯著正相關(guān)，說明此條件下，隨著花瓣pH值的降低，會導致b*值下降，從而提高花瓣藍度。對比3組處理可知，正常條件下‘微藍’花瓣藍度與其亮度、飽和度顯著相關(guān)，遮蔭會提高花色苷與花瓣色彩間的相關(guān)性，SⅠ條件下花色苷含量與pH顯著相關(guān)，SⅡ條件下pH與b*值顯著相關(guān)。

表1 不同處理下‘微藍’各個階段生理生化指標及花色CIE參數(shù)間的相關(guān)系數(shù)

表2顯示，在CK條件下，紅色品種‘梅朗口紅’花瓣pH與L*之間顯著負相關(guān)，a*與C*之間顯著正相關(guān)，說明‘梅朗口紅’花瓣通過pH值影響其亮度，進而影響花色深淺，隨著其紅色積累，花瓣的飽和度隨之升高。在SⅠ條件下，‘梅朗口紅’花瓣pH與a*、C*之間顯著負相關(guān)，AN與a*、C*，以及a*與C*之間顯著正相關(guān)，說明隨著花瓣pH的升高，花瓣紅度和飽和度降低，花瓣顏色減淡，同時該條件下隨著花色苷的積累，花瓣紅色加深。在SⅡ條件下，‘梅朗口紅’花瓣a*與C*之間極顯著正相關(guān)，說明隨著花瓣紅度提高，其飽和度也隨之升高。對比3組處理發(fā)現(xiàn)，適當遮蔭提高了‘梅朗口紅’花瓣pH與色彩間的相關(guān)性，而過度遮蔭會減弱該相關(guān)性。

表2 不同處理下‘梅朗口紅’各個階段生理生化指標及花色CIE參數(shù)間的相關(guān)系數(shù)

由表3來看，在CK條件下，黃色品種‘朝圣者’花瓣a*與b*、C*，以及b*與C*之間顯著正相關(guān)，說明該條件下‘朝圣者’花瓣隨著紅度的增加，彩度和黃度也會增加，花瓣的黃度直接影響其飽和度。在SⅠ條件下，‘朝圣者’花瓣pH與a*之間顯著正相關(guān)，說明該條件下隨著pH的升高花瓣紅色積累越多。在SⅡ條件下，‘朝圣者’花瓣a*與b*、L*與C*之間顯著正相關(guān)，即該條件下隨著花瓣黃色的加深，紅色也在累積，同時其亮度也會升高。因此，適當遮蔭會引起‘朝圣者’花瓣pH和色彩的相關(guān)性，大量遮蔭會提高底色與輔色間的相關(guān)性。

表3 不同處理下‘朝圣者’各個階段生理生化指標及花色CIE參數(shù)間的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明遮蔭處理會導致藍紫色品種‘微藍’花瓣花色苷含量升高的同時使其pH下降，pH的變化影響了花色苷穩(wěn)定性，進而引起花瓣彩度變化，且遮蔭強度越高這一現(xiàn)象表現(xiàn)越顯著。因此，遮蔭可以通過影響花瓣pH值，進而影響花色苷穩(wěn)定性，最后在花色苷和pH的共同作用下使其顯藍紫色。此結(jié)論支持Saito N和Yamaguchi T在觀賞植物花瓣變藍主要是由于pH的變化引起的結(jié)論[17-18]；由于月季缺少合成飛燕草素的關(guān)鍵基因，故其顯藍色無飛燕草色素的作用[19]。

另外，本研究中黃色品種‘朝圣者’在遮蔭25%處理下花瓣顏色穩(wěn)定，但在遮蔭50%條件下花瓣顏色波動較大。這可能是在此條件下有利于類黃酮合成關(guān)鍵基因的表達及抑制產(chǎn)物的光解，引起該品種花瓣類黃酮大量累積，同時由于光解效果減弱，花瓣pH與類黃酮的協(xié)同作用更為顯著，進而增加了pH和色彩的相關(guān)性，以及底色與輔色間的相關(guān)性，因此花瓣黃色和彩度隨之加深。Yang等研究發(fā)現(xiàn)芍藥花瓣顯黃色的原因主要是因為類黃酮的作用[21]，本結(jié)論與之一致；但與本結(jié)論不同的是，萬會花[22]發(fā)現(xiàn)月季顯黃色的原因除類黃酮作用外，還有類胡蘿卜素的作用，這可能是因為不同品種間的差異造成的。

綜上所述，遮蔭對不同色系月季發(fā)育過程中花色變化的影響存在顯著差異，遮蔭50%提高了藍色和黃色品種花色苷相關(guān)物質(zhì)的大量合成，同時減少了相關(guān)產(chǎn)物的光解，進而提高了月季的觀賞性，使其偏黃、偏藍，但對紅色月季品種的作用卻相反，使其花色變淺、泛黃；遮蔭25%對3個品種月季觀賞性的影響較小。但是，本結(jié)論僅基于所研究的3個品種，對于同一色系不同品種月季可能會有不同的結(jié)論，同時造成月季花色變化的原因還有花瓣結(jié)構(gòu)、花瓣營養(yǎng)物質(zhì)等，后續(xù)應進一步深入研究，以得出更系統(tǒng)的結(jié)論。