胡佳蕙,王柏柯,李 寧,余慶輝,王 娟*
(1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所,烏魯木齊 830091;2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,烏魯木齊 830052)
堿性螺旋環(huán)螺旋(basic/Helix-Loop-Helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域高度保守,由堿性區(qū)及螺旋環(huán)螺旋2個部分組成[1],即N端的堿性區(qū)域和緊隨其后的堿性螺旋環(huán)螺旋區(qū)域。這2個區(qū)域的功能分別是DNA結(jié)合和促進(jìn)蛋白-蛋白相互作用[2-3]。bHLH編碼蛋白能識別靶基因的核心DNA序列元件,并與其相互作用[4-5]。近期研究顯示,植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族與植物各階段的生長發(fā)育密切相關(guān),參與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑及應(yīng)對各種環(huán)境脅迫[6]。1989年,首次在玉米中發(fā)現(xiàn)調(diào)控R基因的bHLH轉(zhuǎn)錄因子[7],隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于植物界,如在模式植物擬南芥和水稻中分別鑒定出167個和177個bHLH轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。
研究表明,bHLH能夠通過ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與植物多種非生物脅迫反應(yīng)。在擬南芥中,AtbHLH92[10]、AtbHLH17[11]和AtbHLH122[12]通過ABA依賴途徑響應(yīng)干旱、鹽、氧化或低溫脅迫。葡萄VvbHLH1通過ABA信號通路賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥更好的耐鹽性和抗旱性[13]。最近,有研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中異源表達(dá)MfbHLH38能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡,提高保水能力,增強(qiáng)脅迫誘導(dǎo)的氧化清除系統(tǒng),顯著提高了擬南芥對鹽和干旱的耐受性,并可能參與了ABA依賴的脅迫響應(yīng)途徑[14]。
在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達(dá)植物非生物脅迫響應(yīng)基因,已成為初步探索基因功能的有效方法。Narayan等[15]在E.coli中異源表達(dá)魚腥藻(Anabaenasp.)的PCC 7120all3940(一個Dps家族基因),能有效提高受體E.coli的非生物脅迫耐受性;在E.coli中異源表達(dá)異子蓬(Suaedaaralocaspica)SaPEPC1(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因),能夠促進(jìn)重組細(xì)菌在非生物脅迫下的生長[16];而在E.coli中過表達(dá)番茄SlWRKY6,則降低了重組菌的脅迫耐受性[17]。此外,在抗旱轉(zhuǎn)基因小麥安全性風(fēng)險評價過程中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗旱小麥中的表達(dá)蛋白與E.coli表達(dá)的His-WK融合蛋白具有相似的功能[18]。
野生番茄‘潘那利’(SolanumpennelliiCorrell)多分布于干旱的河床與巖石斜坡。經(jīng)過自然界長期篩選,對干旱環(huán)境產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐受力,其已進(jìn)化出許多抗旱、耐鹽等優(yōu)秀突變體品種(系),積累了豐富的耐旱基因資源[19]?;谄鋬?yōu)良的抗旱能力,本研究從野生‘潘那利’番茄中分離得到一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因SpbHLH89,通過生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位等分析其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu);同時在E.coli中異源表達(dá)SpbHLH89,檢測重組菌對干旱脅迫的耐受性,初步研究該基因的耐旱功能,為番茄抗逆育種提供優(yōu)良的候選基因。
本實(shí)驗(yàn)所用植物材料‘潘那利’番茄(S.pennellii)種子由番茄遺傳資源中心TGRC(Tomato Genetics Resource Center)引進(jìn)。選取飽滿成熟種子播種于營養(yǎng)土和蛭石(體積比為2∶1)的育苗缽中,在溫度25 ℃、光照16 h/黑暗8 h、相對濕度10%~20%、光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)5~6周,取幼嫩葉片液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
用于農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的本氏煙草(NicotianabenthamianaKarel Domin),栽培條件同上,于煙草生長5~6周時選取完全展開的葉片進(jìn)行注射。
1.2.1 番茄總RNA提取及SpbHLH89基因克隆利用植物總RNA提取試劑盒DP441(天根,北京)提取番茄葉片總RNA,利用5×All-In-One RT MasterMix(AccuRT Genomic DNA Removal Kit,Abm,蘇州)合成cDNA,-80 ℃貯存?zhèn)溆?。利用SpbHLH89(Sol Genomics登錄號Sopen04g001150)基因序列設(shè)計引物(表1),以cDNA為模板,分別利用引物pSuper1300-SpbHLH89-GFP-F/R和pET30a-SpbHLH89-F/R擴(kuò)增目的片段連接至pMD19-T克隆載體(TaKaRa,大連)上,利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ,或XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-SpbHLH89,回收純化目的片段連接至原核表達(dá)載體pET30a或植物雙元表達(dá)載體pSuper1300-GFP上。PCR鑒定陽性重組菌落,重組質(zhì)粒雙酶切鑒定測序。序列比對正確的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。
1.2.2 生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位通過在線工具ProtParam分析SpbHLH89的基本理化性質(zhì);利用SMART(http://smart.embl.de)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通過在線軟件NCBI和GenBank數(shù)據(jù)庫檢索與SpbHLH89高度相似的13個不同物種的序列,利用DNAMAN8.0對其進(jìn)行多序列比較,分析bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的保守結(jié)構(gòu);同時利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,利用Neighbor-joining分析方法分析進(jìn)化親緣關(guān)系。
亞細(xì)胞定位分析時,將該基因開放閱讀框的cDNA 3′端與編碼綠色熒光蛋白基因的開放閱讀框的5′端融合。重組表達(dá)載體質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化法,轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101。將重組農(nóng)桿菌GV3101∷pSuper1300-SpbHLH89-GFP活化后,1 200 r/min離心棄上清,棄掉廢液,用煙草轉(zhuǎn)化液重懸菌液調(diào)至OD600為0.8;將重組農(nóng)桿菌、番茄叢矮病毒P19蛋白(促進(jìn)異源蛋白的表達(dá))和類鈣調(diào)磷酸酶亞基B蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)的農(nóng)桿菌按體積比=3∶2∶3混合,室溫靜置2 h;注射葉片,并標(biāo)記注射范圍。注射后保持煙草植株生長條件濕潤。3 d后,激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 800,Carl Zeiss,德國)進(jìn)行觀察,通過ZEN Imaging Software(Version 2.3)捕捉熒光信號并獲取圖像。
1.2.3SpbHLH89基因表達(dá)分析1)組織特異性表達(dá)。取開花期‘潘那利’番茄植株的莖、葉、花,液氮研磨提取植物RNA并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。2)干旱響脅迫下表達(dá)。生長5~6周的‘潘那利’番茄植株進(jìn)行模擬干旱脅迫(0、200、300、500、600 mmol/L甘露醇)處理5 h,并選擇300 mmol/L甘露醇處理植株,分別在脅迫處理前及處理后1、3、6、9 h采取植株葉片,用液氮速凍后與-80 ℃貯存?zhèn)溆?。然后提取其葉片RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Actin基因作為內(nèi)參,用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Qiagen, 德國)和LightCycler96(Roche, 美國)進(jìn)行qRT-PCR,引物序列見表1。
1.2.4SpbHLH89基因原核表達(dá)活化攜帶有重組原核表達(dá)載體pET-30a-SpbHLH89的E.coliBL21(DE3)菌株,利用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h。制備蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測特異表達(dá)目標(biāo)蛋白。將未染色SDS-PAGE膠上的蛋白樣品利用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,用2%脫脂奶粉將鼠抗His-標(biāo)簽的單克隆抗體稀釋2 000倍。第二抗體羊抗鼠IgG稀釋10 000倍,進(jìn)行Western
bloting檢測。顯色用全式金EasySee?Western Blot Kit(DW101-01)避光孵育30 s后于LAS 4000超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(Fujifilm,日本)拍照。
1.2.5 重組菌的脅迫耐受性測定以E.coliBL21(DE3)∷pET-30a為對照菌株,測定重組菌E.coliBL21(DE3)∷pET-30a-SpbHLH89的干旱脅迫耐受性。將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h后的重組菌和對照菌菌液利用液體LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600至1.0,按1% (V/V)接種在分別含有0、200、400、600、800 mmol/L甘露醇和含有0、200、300、400、500 mmol/L NaCl的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃,220 r/min搖床培養(yǎng)12 h后測定菌液OD600,記錄并分析重組菌的干旱脅迫耐受性。將誘導(dǎo)的菌液接種至400 mmol/L NaCl和600 mmol/L甘露醇的LB液體培養(yǎng)基中,每隔2 h取1次樣,測菌液OD600,繪制生長曲線。
1.2.6 統(tǒng)計分析對本體表達(dá)分析qRT-PCR數(shù)據(jù)及重組菌脅迫耐受性測定數(shù)據(jù)均采用軟件Graphad Prism 8.0(GraphPad Software,San Diego,USA)分析,并進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA);通過多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。
表1 本研究所用引物
SpbHLH89基因(Sol Genomics登錄號Sopen04g001150)的開放閱讀框長度為684 bp,編碼227個氨基酸。以‘潘那利’番茄葉片cDNA為模板擴(kuò)增SpbHLH89基因的開放閱讀框序列,將其構(gòu)建于重組質(zhì)粒pET30a-SpbHLH89,pSuper1300-SpbHLH89-GFP并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測序(圖1),將重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)及農(nóng)桿菌GV3101,通過PCR鑒定重組菌中目標(biāo)片段陽性。
M.DL2000;A.SpbHLH89基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切:1.SpbHLH89;2.重組質(zhì)粒;3.Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切;B.重組菌菌落PCR:+.陽性對照;1-2.pET30a-SpbHLH89;3-5.pSuper1300-SpbHLH89-GFP圖1 SpbHLH89基因的cDNA擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M. DL2000; A. PCR of SpbHLH89 gene and double digestion of recombinant plasmid: 1. SpbHLH89; 2. Cloning vector recombinant plasmid; 3. Kpn Ⅰ and Xho Ⅰ digested recombinant plasmid; B. PCR of recombinant. +. Positive control; 1-2. pET30a-SpbHLH89; 3-5. pSuper1300-SpbHLH89-GFPFig.1 PCR amplification of SpbHLH89 and double digestion of recombinant plasmids
通過NCBI網(wǎng)站BlastP對SpbHLH89氨基酸序列進(jìn)行同源比對,保守結(jié)構(gòu)域分析顯示,該序列具有bHLH的典型結(jié)構(gòu)域,SpbHLH89氨基酸序列與芝麻(Sesamumindicum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、豇豆(Vignaunguiculata)等物種的bHLH轉(zhuǎn)錄因子相似性較高(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,番茄SpbHLH89與煙草NtbHLLH094相似性最高(圖3)。
Sp.‘潘那利’番茄;Si.芝麻;So.菠菜;Vr.綠豆;Vu.豇豆;Cc.黃燈籠辣椒;Oe.橄欖樹;Ap.相思子;It.三裂葉薯;Cq.藜麥;Nt.擬絨毛煙草;Sl.番茄;Ce. 咖啡;Ca.辣椒;圖3同圖2 SpbHLH89與其他物種的bHLH序列比對Sp. Solanum pennellii; Si. Sesamum indicum; So. Spinacia oleracea; Vr. Vigna radiata; Vu. Vigna unguiculata;Cc. Capsicum chinense; Oe. Olea europaea; Ap. Abrus precatorius; It. Ipomoea triloba; Cq. Chenopodium quinoa;Nt. Nicotiana tomentosiformis; Sl. Solanum lycopersicum; Ce. Coffea eugenioides; Ca. Capsicum annuum; The same as Fig.3Fig.2 Analysis of conserved domains of SpbHLH89 and its highly homologous proteins
圖3 SpbHLH89與其他物種bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SpbHLH89 and bHLH transcription factors in different species
qRT-PCR分析SpbHLH89在‘潘那利’番茄中的表達(dá),結(jié)果表明,SpbHLH89在番茄不同組織中均有表達(dá)(圖4,A)。不同濃度甘露醇(0、200、300、500、600 mmol/L)處理下,SpbHLH89的表達(dá)隨干旱脅迫增強(qiáng)而升高,在500 mmol/L時,表達(dá)量達(dá)到最高值,且顯著高于處理前及其他處理組(圖4,B)。在500 mmol/L甘露醇處理下,隨著脅迫時間的增加其相對表達(dá)量逐漸增高,在處理6 h時達(dá)到最高值(圖4,C)。
A.不同器官中的表達(dá);B.不同濃度甘露醇脅迫下的表達(dá);C.500 mmol/L甘露醇處理不同時間的表達(dá);不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)圖4 ‘潘那利’番茄SpbHLH89表達(dá)模式分析A.Expression in different organs; B.Expression under different concentrations of mannitol stress; C.Expression under the mannitol of 500 mmol/L at different time points. Different normal letters indicate significant differences (P<0.05)Fig.4 Expression patterns of SpbHLH89 in S. pennellii
bHLH作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá),通常定位于細(xì)胞核并在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[9],SpbHLH89中預(yù)測的NLS(圖2)表示它可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。為了證實(shí)這一推測,利用融合綠色熒光蛋白的SpbHLH89蛋白轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片,利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),SpbHLH89-GFP轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)特異性出現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光,表示轉(zhuǎn)錄因子SpbHLH89蛋白主要在植物細(xì)胞核中表達(dá),這與預(yù)測相符(圖5)。
SDS-PAGE結(jié)果顯示,pET30a-SpbHLH89表達(dá)的特異蛋白條帶在35 kD 與25 kD 之間(圖6,A)。Western bloting分析顯示,誘導(dǎo)表達(dá)的攜帶His-標(biāo)簽重組蛋白能與單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng),在約31 kD 處產(chǎn)生單一免疫條帶,表明SpbHLH89-His重組蛋白正確表達(dá)(圖6,B)。
A.SDS-PAGE:M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1.IPTG誘導(dǎo)的pET-30a-SpbHLH89;2.未誘導(dǎo)的重組菌;B.Western bloting:M.預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1.重組菌的IPTG誘導(dǎo);2.重組菌未誘導(dǎo)圖6 SpbHLH89重組蛋白的SDS-PAGE及Western bloting分析A. SDS-PAGE: M. Standard molecular weight of protein;1. IPTG induced pET-30a-SpbHLH89; 2. pET-30a-SpbHLH89 was not induced; B. Western blotting: M. Molecular weight standards for prestained proteins; 1. IPTG induced pET-30a-SpbHLH89; 2. pET-30a-SpbHLH89 was not inducedFig.6 Analysis of recombinant SpbHLH89 protein by SDS-PAGE and Western blotting
為進(jìn)一步探究SpbHLH89在響應(yīng)非生物脅迫中的生物學(xué)功能,分析了在E.coliBL21(DE3)中異源表達(dá)SpbHLH89對大腸桿菌耐旱性的影響,比較不同濃度鹽或甘露醇脅迫下重組菌E.coliBL21(DE3)∷pET30a-SpbHLH89與對照菌株E.coliBL21(DE3)∷pET30a的生長情況。結(jié)果(圖7,A、B)顯示,隨著鹽或甘露醇濃度增加,鹽、干旱脅迫逐漸嚴(yán)重,菌株生長速度逐漸降低,但重組菌在脅迫下比對照菌株生長狀況更好。
重組菌與對照菌株在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(圖7,C),發(fā)現(xiàn)重組菌與對照菌株在12 h內(nèi)的生長情況基本一致。進(jìn)一步進(jìn)行600 mmol/L甘露醇模擬干旱脅迫及400 mmol/L NaCl處理(圖7,D、E),發(fā)現(xiàn)對照菌株的生長受到嚴(yán)重抑制,而表達(dá)SpbHLH89重組蛋白的菌株相較于對照菌株生長狀態(tài)顯著提高。說明SpbHLH89的表達(dá)增強(qiáng)了受體大腸桿菌對鹽、干旱脅迫的耐受性。
不同小寫字母表示同一處理不同濃度間差異顯著(P<0.05),*、***和 ****分別表示同一濃度處理重組菌與對照菌之間在0.05、0.001和0.0001水平差異顯著性(P<0.05, P<0.001和P<0.0001)圖7 重組菌脅迫耐受性Different normal letters indicate significant differences (P<0.05). *, *** and **** represent significant difference(P<0.05, P<0.001 and P<0.0001) between the recombinant and control bacteria strains at the same concentrationFig.7 Stress tolerance of recombinant bacteria
bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族,其主要在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[20]。多項(xiàng)研究表明該轉(zhuǎn)錄因子能積極響應(yīng)多種逆境脅迫[21],低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫條件可誘導(dǎo)bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[22-23]。在擬南芥中,AtbHLH122受干旱脅迫表達(dá)量增加[14]。在水稻中,bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH148和OsbHLH006通過參與茉莉酸信號途徑,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而提高植株干旱耐受性[24]。在梨中,通過對PbrbHLH基因家族的鑒定及表達(dá)模式分析,結(jié)果表明PbrbHLH能積極響應(yīng)干旱和冷脅迫[25]。在楊樹中,PebHLH35經(jīng)干旱和鹽脅迫其表達(dá)水平提高[26]。在蘋果中MdbHLH106L的表達(dá)水平和啟動子活性在鹽脅迫下呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)[27]。本研究結(jié)果顯示,潘那利番茄SpbHLH89主要定位于細(xì)胞核,該轉(zhuǎn)錄因子受干旱脅迫誘導(dǎo),其表達(dá)量隨脅迫程度加劇而明顯增高。
為進(jìn)一步驗(yàn)證SpbHLH89的耐旱功能,本研究借助原核表達(dá)途徑,將潘那利番茄SpbHLH89在E.coli中異源表達(dá)。據(jù)研究報道在E.coli中異源表達(dá)非生物脅迫相關(guān)基因可初步驗(yàn)證其脅迫耐受性,例如大豆抗旱負(fù)調(diào)控基因GmGols,其降低了重組菌的活力,表現(xiàn)出對干旱脅迫更加敏感[29];番茄SlWRKY16的抗逆分析研究中,也顯示表達(dá)融合蛋白WRKY的重組大腸桿菌,降低了自身鹽、旱脅迫耐受性[30]。本研究結(jié)果顯示,在E.coli異源表達(dá)SpbHLH89可顯著提高重組菌對鹽、旱脅迫的耐受性,此結(jié)果與Wang等[28]結(jié)果一致,初步實(shí)現(xiàn)對SpbHLH89的耐旱功能驗(yàn)證,然其在植物中抗逆功能有待進(jìn)一步研究。