宋秀麗，黃瑞龍，柯彩杰，黃蔚，章武*，陶波

1. 嶺南師范學(xué)院，廣東 湛江 524048；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030

土壤微生物是土壤中生命活性物質(zhì)，參與土壤中物質(zhì)循環(huán)和能量代謝，對(duì)維持農(nóng)田土壤肥力，保持土壤健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)具有重要作用（宋長(zhǎng)青等，2013；蔡元鋒等，2014；潘孝晨等，2019）?；?6S rRNA基因的分子生物技術(shù)能夠較全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和物種遺傳多樣性，目前已被廣泛地應(yīng)用在土壤微生物群落的研究上（Edgar，2013；夏圍圍等，2014）。

大豆（Glycine max）是中國(guó)重要糧食作物之一，也是東北黑土區(qū)旱地主要種植作物之一。由于土地資源有限、經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)及種植習(xí)性，大豆連作為當(dāng)?shù)刂饕N植方式。在連作過(guò)程中出現(xiàn)的連作障礙，增加植物的發(fā)病率，影響作物的健康，其中大豆根腐病和包囊線蟲(chóng)成為制約大豆生產(chǎn)的重要病害（Mo et al.，2016；Xiong et al.，2016；宋杰，2016）。選用大豆抗病品種，將大豆與其他作物進(jìn)行輪作種植是目前防治病害的主要措施（Perez-Brandan et al.，2014；王芳等，2018）。不同的農(nóng)業(yè)種植方式影響著土壤中的化學(xué)、物理和生物過(guò)程，并引發(fā)土壤微生物群落組成的變化（Fierer et al.，2012）。增加作物類(lèi)型和輪作能夠促進(jìn)土壤養(yǎng)分的合理利用，協(xié)調(diào)土壤微生物的豐富度和均勻度，增加作物抗病性（Tian et al.，2015：Wang et al.，2015；Benitez et al.，2017）。也有研究表明，大豆長(zhǎng)期連作可以減輕連作障礙。大豆連作14年，土壤中大豆根腐病潛在病原菌鐮孢菌屬的物種豐度顯著降低（Hamid et al.，2017；Liu et al.，2019）。

土壤細(xì)菌是養(yǎng)分活化的驅(qū)動(dòng)者，是土壤微生物中的重要群體，同時(shí)是一些植物病原物的拮抗菌（Mendes et al.，2011）。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同種植方式下大豆細(xì)菌群落多樣性的研究表明，種植方式對(duì)土壤中細(xì)菌豐度和多樣性都產(chǎn)生了影響，并且土壤中有效 N和有機(jī)質(zhì)（OM）對(duì)微生物群落影響較大（Fan et al.，2011；周嵐等，2013）。目前，關(guān)于作物輪作緩解連作障礙的研究報(bào)道較多（Tan et al.，2016：李銳等，2015），但在大豆長(zhǎng)期連作的土壤上，不同種植方式對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響尚不明確。因此本研究基于 Illumina MiSeq第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，設(shè)置休耕、休耕-大豆、玉米-大豆、小麥-大豆和大豆連作 5個(gè)處理，研究5種種植方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成、物種多樣性的影響，并與土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為優(yōu)化大豆種植，改善土壤微生態(tài)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)于 2005年開(kāi)始，試驗(yàn)地位于中國(guó)北方黑龍江省黑河市嫩江中儲(chǔ)糧公司四場(chǎng)第五中隊(duì)。嫩江是中國(guó)大豆之鄉(xiāng)，是麥豆主要生產(chǎn)區(qū)，土壤類(lèi)型為黑土。試驗(yàn)地氣候?qū)儆诤疁貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，地理坐標(biāo)為 125°27′E，49°33′N(xiāo)。當(dāng)?shù)啬昶骄鶜鉁貫?.8—1.4 ℃，平均降雨量為480—512 mm，冬季寒冷、漫長(zhǎng)、干燥，最低氣溫為-47.3— -43.7 ℃；夏季雨熱同季，最高氣溫為33.9—37.4 ℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2005年3月之前實(shí)驗(yàn)地為大豆連作種植區(qū)域，2005年4月開(kāi)始設(shè)置5種種植方式處理：休耕地塊（CK）、大豆連作種植（SC）、休耕-大豆輪作種植（FS）、玉米-大豆輪作種植（CS）和小麥-大豆輪作種植（WS），每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積666.7 m2，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。作物種植前使用尿素、磷酸二銨和硫酸鉀3種肥料。大豆每年施用 33.1 kg·hm-2N、24.1 kg·hm-2P 和 21.6 kg·hm-2K，玉米施用 59.0 kg·hm-2N、40.1 kg·hm-2P 和 43.1 kg·hm-2K，以及小麥?zhǔn)┯?73.0 kg·hm-2N、30.1 kg·hm-2P 和 21.6 kg·hm-2K。在玉米的孕穗階段額外施用59.0 kg·hm-2N。

1.3 土壤取樣

于2016年10月30日秋季大豆成熟后進(jìn)行土壤樣品采集。每個(gè)小區(qū)采用5點(diǎn)法在作物根部周?chē)猛零@采耕層土（直徑5 cm，深20 cm），裝入密封袋，重復(fù)3次，混合為一個(gè)土壤樣品，裝入干凈的無(wú)菌自封袋中。將共15份土壤樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除作物根系殘?bào)w和雜物，取一份樣品于-80 ℃冰箱中保存，用于土壤微生物分析，另一份樣品用于土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。

1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤樣本室溫風(fēng)干后磨碎，過(guò)0.2 mm篩。微量元素有效態(tài)銅（Cu）、鐵（Fe）、錳（Mn）和鋅（Zn）用0.005 mol·L-1二乙三胺乙酸提取后，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定；有效態(tài)硼（B）用鉀亞胺比色法測(cè)定；土壤pH按水土比2.5∶1進(jìn)行前處理，然后用pH計(jì)測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)（OM）使用重鉻酸鉀容量法檢測(cè)；有效磷（P）用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法檢測(cè)；有效氮（N）采用擴(kuò)散法檢測(cè)；有效鉀（K）采用1 mol·L-1NH4OAc浸提-火焰光度法檢測(cè)（魯如坤，2000）。

1.5 土壤細(xì)菌總DNA的提取及16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序

使用土壤基因組DNA試劑盒（Power Soil? DNA Isolation Kit，MoBio Laboratories Inc.，CA）提取 0.5 g土壤樣品的總DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量。以前端引物343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）和后端引物798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）對(duì) 16S rRNA 基因的V4—V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min。擴(kuò)增結(jié)束后，使用2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢查擴(kuò)增效果。切取目的片段后，用Axygen凝膠回收試劑盒回收。將回收的目的片段進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將同一個(gè)樣本的3個(gè)平行擴(kuò)增產(chǎn)物混合得到一個(gè)樣本的原始文庫(kù)。采用Illumina Miseq二代高通量測(cè)序平臺(tái)2×250 bp的雙端測(cè)序策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。土壤微生物測(cè)序服務(wù)委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

首先對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行過(guò)濾，得到有效序列，然后對(duì)有效序列進(jìn)行去雜優(yōu)化，采用UPARSE聚類(lèi)方法將經(jīng)過(guò)質(zhì)控后的序列按序列間 97%的相似性進(jìn)行聚類(lèi)，形成不同的分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）。利用 mothur（Version 1.33.3）進(jìn)行Alpha多樣性分析（Chao、ACE等物種豐富度統(tǒng)計(jì)，Shannon、Simpson等物種多樣性統(tǒng)計(jì)）、Venn圖繪制，Beta多樣性分析（PCA分析）。利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總及相關(guān)系數(shù)等計(jì)算分析，利用SPSS 19.0軟件中的Duncan分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。所有樣品相似度樹(shù)圖、Venn圖、PCA分析圖、微生物群落組成結(jié)構(gòu)等制圖通過(guò)R語(yǔ)言軟件的ggplot 2程序包完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植方式對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

由表1可知，不同種植方式對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05）。與CK相比，SC土壤中OM、有效N、K、Zn、Fe和Mn含量顯著增加，有效P顯著降低。FS土壤中有效Cu、Mn和P含量顯著降低。WS土壤有效P和Cu含量顯著增加，土壤中OM、有效N和Fe顯著低。CS土壤中有效K和Zn含量顯著降低。CK土壤中OM、有效K和Mn的含量顯著高，有效Cu和Fe含量顯著低?？梢?jiàn)，不同種植方式顯著改變了土壤化學(xué)性質(zhì)。

表1 不同種植方式對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 1 Soil chemical properties of different cropping systems

2.2 不同種植方式土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

對(duì)各樣品細(xì)菌群落物種豐度及分布進(jìn)行PCA，由圖1a可知，主成分1和主成分2分別占51.807%和 17.979%，樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。5種種植方式下土壤細(xì)菌群落分成3組，其中休耕和輪作處理細(xì)菌群落顯著不同于 SC處理，F(xiàn)S與CK細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，WS和CS細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，并且WS和CS細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似程度較高（圖1b），說(shuō)明不同輪作方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。

圖1 不同種植方式土壤細(xì)菌群落的相似度分析Figure 1 Differences of soil bacterial community structure in different cropping systems

2.3 不同種植方式對(duì)土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性的影響

如表2所示，不同種植方式下土壤細(xì)菌菌群豐度及菌群多樣性差異顯著（P＜0.05）。FS土壤中細(xì)菌菌群豐度（Chao1/ACE）和菌群多樣性（Shannon）顯著增高（表1）(P＜0.05)，其他種植方式下細(xì)菌群落豐度和多樣性差異不顯著。菌群豐度總體表現(xiàn)為FS＞CK＞CS＞W(wǎng)S＞SC，菌群多樣性總體表現(xiàn)為FS＞W(wǎng)S＞CS＞CK＞SC。與 SC 相比，F(xiàn)S、CS和 WS種植方式能夠增加土壤中細(xì)菌菌群豐度和菌群多樣性。

表2 不同種植方式土壤細(xì)菌群落的豐度及多樣性Table 2 Effects of different cropping systems on bacterial community abundance and diversity

如圖2所示，5種種植方式下土壤環(huán)境中共有細(xì)菌OTUs數(shù)量為2376個(gè)。CK土壤中細(xì)菌OTUs有4965個(gè)，其中特有OTUs有747個(gè)。FS土壤中細(xì)菌OTUs有5788個(gè)，其中特有OTUs有535個(gè)。CS土壤中細(xì)菌OTUs有4893個(gè)，其中特有OTUs有183個(gè)。WS土壤中細(xì)菌OTUs有4789個(gè)，其中特有OTUs有225個(gè)。SC土壤中細(xì)菌OTUs有4835個(gè)，其中特有OTUs有268個(gè)?？梢?jiàn)，不同種植方式土壤環(huán)境中細(xì)菌OTUs呈現(xiàn)差異，并且不同種植方式改變了土壤特有OTUs的數(shù)量，進(jìn)而影響了土壤細(xì)菌群落豐度和均勻度。

圖2 不同種植方式土壤細(xì)菌OTUs的Venn圖Figure 2 Venn diagram of soil bacteria OTUs under different cropping systems

2.4 不同種植方式對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

由圖3可知，東北黑土土壤中細(xì)菌群落主要分布在變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）中。在所有種植方式的土壤中，Proteobacteria相對(duì)豐度顯著最高，占細(xì)菌群落的23%—37%。與其他處理相比，SC土壤中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增高，酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度減少。擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度占比為13%—20%，其中WS土壤中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度最低。放線菌門(mén)的相對(duì)豐度占比為4%—14%，與其他處理相比，在FS土壤中相對(duì)豐度顯著降低。因此，不同種植方式顯著改變了土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的相對(duì)豐度，影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成。

圖3 不同種植方式土壤細(xì)菌在門(mén)水平上的物種組成變化Figure 3 Changes in species annotation to OTUs of soil bacteria from different cropping systems at the phylum level

由圖 4可知Gp4、Gp6、Gemmatimonas、Gp1 Gaiella、WPS-1_genera_incertae_sedi、Flavobacteriu、Gp3、Rhizomicrobium、Rhodanobacter、Terrimonas、opitutus和Pedobacter菌群在土壤中相對(duì)豐度較高，是東北黑土土壤細(xì)菌群落的主要菌屬。SC土壤中Gp4相對(duì)豐度為2.51%，與SC相比，CK、FS、CS和 WS土壤中Gp4的相對(duì)豐度顯著增高，分別為9.43%、4.51%、6.35%和5.28%。Gp6的相對(duì)豐度在SC中為2.13%，與之相比，其相對(duì)豐度在CK、FS、CS和WS土壤中顯著增高，分別為5.37%、4.99%、4.03%和4.51%。Gemmatimonas的相對(duì)豐度在SC中為1.97%，與之相比，其相對(duì)豐度在CK、FS、CS和WS土壤中顯著增高，分別為2.61%、2.40%、2.91%和4.56%?？梢?jiàn)休耕和輪作處理顯著改變了優(yōu)勢(shì)菌屬在群落中的相對(duì)豐度。

圖4 不同種植方式土壤細(xì)菌在屬水平上的物種組成變化Figure 4 Changes in species annotation to OTUs of soil bacteria from different cropping systems at a genus

硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、厭氧蠅菌（Anaerolinea）、固氮菌（Azotobacter）及產(chǎn)甲烷菌的甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina，厭氧菌）是土壤中的潛在有益菌，可促進(jìn)土壤化學(xué)循環(huán)，保持土壤肥力。根瘤菌（Rhizobium）有利于作物對(duì)氮的吸收。芽孢桿菌（Bacills）是增加植物抗病性的潛在有益菌。在FS土壤中，硝化螺旋菌屬、厭氧蠅菌、固氮菌及甲烷八疊球菌屬相對(duì)豐度顯著最高（表3）。與SC相比，F(xiàn)S處理的硝化螺旋菌屬和固氮菌的相對(duì)豐度分別增加了0.47%和0.37%。在5個(gè)處理中，根瘤菌在SC、WS和CS土壤中顯著增高，在CK和FS中顯著降低（P＜0.05）。芽孢桿菌的相對(duì)豐度在WS中顯著最高，在CK和FS土壤中最低（表 3）?？梢?jiàn)，不同種植方式顯著改變了土壤土壤中有益細(xì)菌的相對(duì)豐度。

表3 不同種植方式下潛在有益菌的相對(duì)豐度Table 3 Relative abundance of potentially beneficial bacteria in different cropping systems

2.5 土壤細(xì)菌主要類(lèi)群相對(duì)豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性

將所有樣品的細(xì)菌菌群與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)土壤中Proteobacteria菌群與土壤中P和Cu極顯著正相關(guān)；Acidobacteria與OM顯著正相關(guān)，與P、Cu極顯著負(fù)相關(guān)；Bacteroidetes與有效P、Cu、pH和Mn含量顯著正相關(guān)；Actinobacteria與OM、有效K和Mn呈極顯著負(fù)相關(guān)（表4）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與土壤化學(xué)性質(zhì)存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）（表 5）。Gp4與有效Cu和Zn含量極顯著負(fù)相關(guān)；Gp6與OM、有效N極顯著正相關(guān)，與有效P、Cu含量極顯著負(fù)相關(guān)；Gemmatimonas與有效P和Cu含量極顯著負(fù)相關(guān)；Gp1與有效Fe含量極顯著正相關(guān)，與pH極顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)，土壤中其他優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤OM和有效P、Cu、Mn等呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。土壤中Nitrospira與土壤 OM和 N、Zn、Fe的有效含量顯著相關(guān)；Rhizobium與土壤OM和N、K、Mn有效含量顯著相關(guān)；Azotobacter與土壤N、Zn和Fe有效含量顯著相關(guān)；Bacills與土壤pH和K、Mn有效含量顯著相關(guān)?？梢?jiàn)，土壤中細(xì)菌有益菌群與不同土壤化學(xué)性質(zhì)呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（表6）。

表4 土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)關(guān)系Table 4 Correlations between dominant phyla of soil bacteria and soil chemical properties

表5 土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)關(guān)系Table 5 Correlations between potentially beneficial bacteria and soil chemical properties

表6 潛在有益菌與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性Table 6 Correlations between potentially beneficial bacteria and soil chemical properties

3 討論

3.1 不同種植方式對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成與土壤環(huán)境密切相關(guān)，種植方式會(huì)引起土壤理化性質(zhì)、水汽熱條件的變化，進(jìn)而改變微生物群落結(jié)構(gòu)。研究證明，變形菌、酸桿菌、擬桿菌和放線菌是農(nóng)田土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群（Liu et al.，2017）。不同種植方式在一定程度上改變了變形菌、擬桿菌、酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度（Li et al.，2014）。在本研究中，5種種植方式下變形菌是土壤中最豐富的的類(lèi)群，相對(duì)豐度在23%—37%，這與前人研究結(jié)果一致（沈冰潔等，2015；朱琳等，2017）。與連作相比，輪作處理顯著降低了土壤中變形菌的相對(duì)豐度，增加了酸桿菌的相對(duì)豐度，這與前人研究結(jié)果不一致。朱英波等（2014）對(duì)黑龍江富錦地區(qū)兩個(gè)相鄰的大豆土壤細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，輪作土壤以變形菌為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，連作以酸桿菌為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。研究結(jié)果不同表明，不同門(mén)類(lèi)細(xì)菌在不同生態(tài)區(qū)和不同種植方式下所占比例不同。

大豆連作障礙一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，針對(duì)不同土壤、不同種植方式下大豆田土壤微生物變化已有諸多研究。由于生態(tài)環(huán)境、種植方式以及種植年限不同，微生物類(lèi)群及其豐度變化的結(jié)果也不盡相同。眾多研究證明，大豆連作后大豆根際分泌物及單一的田間管理導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境向著利于病原真菌積累的方向偏移（Li et al.，2014）。研究證明黑龍江西部地區(qū)大豆經(jīng)過(guò)短期連作后，大豆根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度增加（王芳等，2018）。輪作和大豆短期連作（2年和4年連作）土壤多樣性高于長(zhǎng)期連作（連作7年）（陳雪麗，2015）。因此，大豆土壤細(xì)菌群落豐度主要是隨著大豆連作年限的增加呈現(xiàn)先增加而后降低的現(xiàn)象。也有研究證明長(zhǎng)期連作導(dǎo)致健康土壤向致病土壤再向抑病土壤的轉(zhuǎn)變（Schreiner et al.，2010）。研究證明，土壤抑病功能是由不同功能生物類(lèi)群結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的，包括細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群豐度變更和土壤中有益菌的增加（王闖進(jìn)，2014）。研究證明長(zhǎng)期連作（20年）土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與輪作土壤的相似度更高，并且一些有益菌的豐度高于輪作土壤的，如與固氮有關(guān)的根瘤菌，以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)和對(duì)病原菌有防控作用的芽孢桿菌的豐度在連作4年、10年土壤中都高于在輪作土壤中。硝化螺旋菌屬、厭氧蠅菌、固氮菌和甲烷八疊球菌屬有助于土壤中的亞硝酸氧化成硝酸鹽，進(jìn)而提高土壤的氮肥（Li et al.，2018）。本研究中大豆連作促進(jìn)了土壤根瘤菌相對(duì)豐度的增高，小麥-大豆輪作促進(jìn)了芽孢桿菌相對(duì)豐度的增高，而休耕-大豆輪作促進(jìn)了硝化螺旋菌屬、厭氧蠅菌、固氮菌和甲烷八疊球菌屬相對(duì)豐度的增高。同時(shí)玉米-大豆和小麥-大豆輪作土壤中的硝化螺旋菌屬也顯著高于大豆連作土壤中的。這一現(xiàn)象說(shuō)明在大豆連作土壤上實(shí)施休耕-大豆輪作及其他輪作更利于增加土壤中有益菌群的豐度，進(jìn)而提高土壤地力。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性決定了土壤微生物群落的穩(wěn)定性及其抗逆能力，是土壤生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的重要指標(biāo)（Smith et al.，2008）。Yin et al.（2010）研究顯示，與連作相比，輪作體系顯著改變微生物的群落結(jié)構(gòu)。然而，Venter et al（.2016）發(fā)現(xiàn)輪作條件下微生物群落并不發(fā)生改變，且不同的研究手段、輪作方式、種植年限等因素會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生差異。本研究證實(shí)，大豆連作土壤中細(xì)菌菌群豐度（Chao1/ACE）和菌群多樣性最低，3中輪作種植方式都改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，其中休耕-大豆輪作能夠顯著增加土壤中細(xì)菌菌群豐度（Chao1/ACE）和菌群多樣性（Shannon）。通過(guò)分析韋恩圖發(fā)現(xiàn)，休耕顯著增加了土壤中特有 OTUs的數(shù)量，因此提高了土壤微生物多樣性數(shù)值。研究表明休耕有利于耕層中水分與溫度的保持，因此促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖（徐光輝等，2018）。本研究中小麥-大豆和玉米-大豆輪作土壤中的細(xì)菌群落豐度和多樣性也高于大豆連作土壤中的。輪作通過(guò)增加作物的種類(lèi)和生物量的方式增加土壤微生物的食物來(lái)源，進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物多樣性增加（Wang et al.，2011）。因此本研究證實(shí)，在大豆連作土壤上增加休耕和輪作制度可以改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加群落多樣性（Navarro et al.，2013；Ai et al.，2015）。

3.2 不同種植方式土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物的相關(guān)性

據(jù)報(bào)道，不同的作物種植方式使得土壤中營(yíng)養(yǎng)元素利用和轉(zhuǎn)化效率不同，進(jìn)而使土壤形成不同的肥力性質(zhì)（Xun et al.，2015）。連作可能導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失調(diào)（劉株秀等，2019）。研究證明，大豆連作脅迫導(dǎo)致土壤有效Zn、Mn和Fe增加（韓麗梅等，2000）。研究發(fā)現(xiàn)，與大豆連作相比，種植玉米、小麥對(duì)土壤P的需求相對(duì)減少，利于土壤有效磷的積累（李玉潔等，2015）。也有研究證明輪作5年和大豆連作13年顯著增加了土壤pH和有效養(yǎng)分含量（劉株秀等，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)大豆連作土壤中OM和有效N、K、Zn、Fe、Mn顯著增加，有效P顯著降低；休耕-大豆輪作消耗了土壤中有效Mn含量；小麥-大豆輪作消耗了土壤OM和有效N、Fe的含量，而促進(jìn)土壤有效P和Cu含量的積累。因此，不同生態(tài)環(huán)境、種植方式和種植時(shí)間會(huì)顯著影響土壤化學(xué)性質(zhì)。

研究證明，土壤化學(xué)性質(zhì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，土壤中OM和有效N含量的增加可以促進(jìn)細(xì)菌多樣性的形成（Liu et al.，2014；Li et al.，2018）。隨著土壤養(yǎng)分的積累，變形菌的相對(duì)豐度增加（Zeng et al.，2017）。通過(guò)相關(guān)性分析，本研究土壤中變形菌與土壤中有效P和Cu含量顯著相關(guān)；擬桿菌與土壤有效P、Cu和Mn的含量顯著相關(guān)；放線菌與土壤中OM和有效Mn含量顯著負(fù)相關(guān)；酸桿菌與OM正相關(guān)，與有效Cu負(fù)相關(guān)。一些研究證明土壤 pH是決定細(xì)菌群落演替的主導(dǎo)因子（Pii et al.，2015），而本研究證明OM、P、Cu、Mn與土壤細(xì)菌群落相關(guān)性更大，這可能是由于本研究的土壤樣本間pH差異不顯著，而微量元素差異顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，種植方式、土壤化學(xué)性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是具有相關(guān)性（Ofek et al.，2014；Pang et al.，2017）。以上研究結(jié)果表明，不同種植方式及土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)各類(lèi)土壤細(xì)菌群落影響不一致。

4 結(jié)論

與大豆連作處理相比，休耕與輪作顯著改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。休耕-大豆能夠顯著促進(jìn)土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度和多樣性的形成，小麥-大豆輪促進(jìn)效果作次之；休耕與休耕-大豆細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近，并且促進(jìn)了土壤中特有OTUs的形成。休耕、輪作處理顯著降低了變形菌門(mén)的相對(duì)豐度，增加了酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度；同時(shí)休耕和輪作處理顯著改變了土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬在群落中的相對(duì)豐度，尤其是顯著增加了Gp4、Gp6和Gemmatimonas的相對(duì)豐度。休耕-大豆輪作處理顯著增加了土壤中硝化螺旋菌屬、厭氧蠅菌、固氮菌及產(chǎn)甲烷菌的甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度，小麥-大豆輪作能夠促進(jìn)土壤中芽孢桿菌的相對(duì)豐度，有利于增加土壤抗病性。因此在大豆連作地區(qū)實(shí)施休耕-大豆輪作和小麥-大豆輪作更利于土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性的形成。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)不同種植方式顯著改變了土壤化學(xué)性質(zhì)，并且土壤中優(yōu)勢(shì)菌群與土壤OM，有效P、Cu、Mn等化學(xué)性質(zhì)的含量呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。因此，種植方式和土壤化學(xué)性質(zhì)能夠調(diào)控土壤細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)。