陳輝耀 董欣然 楊 琳 盧宇藍(lán) 胡黎園 蔣思遠(yuǎn) 錢莉玲 周文浩

支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)最常見的并發(fā)癥之一[1]，嚴(yán)重RDS患兒需機械通氣支持，但高濃度吸氧和高吸氣峰壓卻大幅增加了患BPD的風(fēng)險[2]。國外研究表明，胎齡<34周的RDS新生兒中BPD發(fā)生率為12.5%～14%[3]。一旦發(fā)生BPD的，會導(dǎo)致持續(xù)肺功能障礙(慢性哮喘、反復(fù)呼吸道感染)和神經(jīng)發(fā)育遲緩。

影響RDS患兒并發(fā)BPD的因素較多，如胎齡、出生體重、動脈導(dǎo)管未閉、機械通氣模式等[4-6]。除臨床因素外，多項研究通過全外顯子組測序和罕見變異分析確定了大量BPD的風(fēng)險基因[7-9]，表明遺傳因素會增加早產(chǎn)兒患BPD的風(fēng)險。本研究假設(shè)RDS并發(fā)BPD人群具有較高的BPD遺傳易感基因罕見變異負(fù)荷，從而作為篩選RDS并發(fā)BPD的遺傳風(fēng)險基因，為準(zhǔn)確預(yù)測患兒預(yù)后和精準(zhǔn)醫(yī)療提供參考。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 巢式病例對照研究。以RDS為隊列人群，以生后28 d為隊列終點，診斷為BPD患兒為BPD組，在非BPD患兒中采用傾向性評分策略產(chǎn)生非BPD的組，通過罕見變異關(guān)聯(lián)分析和基因差異表達分析，探索具有高變異負(fù)荷基因表達特征的暴露因素。

1.2 倫理和知情同意 本研究方案獲得復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：2016-235)。在基因檢測前所有患兒父母均簽署書面知情同意。

1.3 BPD組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 同時符合以下條件：①2016年1月1日至2021年8月1日我院信息管理系統(tǒng)中符合RDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]的病歷，②胎齡≤34周，③生后24 h內(nèi)入院且住院時間≥28 d，④臨床懷疑有遺傳性疾病并行臨床外顯子檢測，⑤排除嚴(yán)重遺傳疾病(如先天性畸形、染色體異常)的患兒，⑥出院診斷中合并BPD[11]。

1.4 非BPD組納入標(biāo)準(zhǔn) 同BPD組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)①～⑤，并排除出院診斷中合并BPD的患兒。復(fù)習(xí)文獻[4, 6, 11]顯示，BPD高危因素研究中胎齡是最重要和確切的因素，本研究使用R軟件包MatchIt對BPD組和非BPD組的胎齡進行傾向性評分匹配，采用臨近匹配方法，匹配比例為1∶2，在匹配中使用的卡尺寬度為0.5。

1.5 臨床信息采集 復(fù)習(xí)文獻[4, 6, 11]，從病歷中采集BPD影響因素，①出生史：剖宮產(chǎn)分娩、產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素、1和5 min Apgar評分、出生體重、胎齡、性別、小于胎齡兒；②住院期間發(fā)病情況：低蛋白血癥、肺動脈高壓(新生兒持續(xù)性肺動脈高壓/繼發(fā)性肺動脈高壓)、氣胸、動脈導(dǎo)管未閉、新生兒肺炎、早發(fā)性敗血癥，侵入性通氣(有創(chuàng)機械通氣、高頻通氣)。

1.6 遺傳風(fēng)險基因檢測、采集和分析

1.6.1 臨床外顯子測序 采集患兒外周靜脈血行外顯子檢測，使用的遺傳性疾病試劑盒(Agilent ClearSeq Inherited Disease Kit)可捕獲2 742個已知的致病基因的罕見有害變異(包括潛在的有害變異)。罕見變異篩選具體步驟參考文獻[12]。

1.6.2 生物學(xué)過程基因集采集 下載MSigDB(www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)數(shù)據(jù)庫中定義的基因集，選擇7.4版中的生物學(xué)過程(BP)組別中的7 481個基因集進行后續(xù)的功能富集分析。

1.6.3 基因功能富集分析 使用Fisher精確檢驗進行風(fēng)險基因功能富集分析，背景基因選取所有檢測的3 203個基因，顯著性閾值是P< 0.01。

1.6.4 基因集罕見變異關(guān)聯(lián)分析 將不同樣本中同一基因集的罕見(最小等位基因頻率<1%)有害變異合并到同一基因集區(qū)域中，對具有此基因集有害變異的基因個數(shù)進行累加計數(shù)。將有害變異分為4種類型：蛋白質(zhì)截斷變異(移碼突變、終止密碼子突變和經(jīng)典剪接供體/受體突變)、錯義/非同義變異、同義變異和非編碼變異[13]。將同義變異和非編碼變異作為協(xié)變量，應(yīng)用Logistic多因素回歸分析BPD組中攜帶蛋白質(zhì)截斷變異和錯義/非同義變異的基因數(shù)是否明顯高于非BPD組。以因變量y表示是否患BPD，以樣本在相應(yīng)基因集中攜帶罕見變異基因的個數(shù)為自變量，相應(yīng)的logistic回歸模型為：

Logit(P) = ln(P/(1-P))=β0+β1X1+β2X2+β3X3

式中P=(y=1|x1,x2,x3)；y=1表示患BPD，y=0表示未患BPD；X1表示攜帶蛋白質(zhì)截斷變異(或錯義和非同義變異)基因的個數(shù)；X2表示攜帶同義變異基因的個數(shù)；X3表示攜帶非編碼變異基因的個數(shù)。

針對測序的2 742個基因富集的生物學(xué)過程相關(guān)基因集(P<0.01)進行關(guān)聯(lián)分析。

1.6.5 基因罕見變異關(guān)聯(lián)分析 將不同樣本中同一基因的罕見有害變異合并到同一基因區(qū)域中，對具有此基因有害變異的樣本進行累加計數(shù)。在基因水平上應(yīng)用單側(cè)Fisher檢驗分析BPD組中攜帶蛋白質(zhì)截斷變異和錯義/非同義變異的總?cè)藬?shù)是否明顯高于非BPD組。

1.6.6 RDS并發(fā)BPD候選風(fēng)險基因差異表達驗證方法 研究[14]表明，基因外顯子在不同人群的相同組織中表達水平不同，這些表達差異可能意味著不同的罕見變異可以造成不同的表型結(jié)果。因此，本研究從GEO(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫檢索RDS并發(fā)BPD高度相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)，驗證本文高變異負(fù)荷基因的表達特征。行機械通氣的RDS患兒肺巨噬細(xì)胞的基因表達數(shù)據(jù)GSE149490[15]包含了62例(重度BPD 34例、中度BPD 5例、輕度BPD 9例、無BPD 9例)。行機械通氣的RDS患兒113份氣道內(nèi)吸引物樣本,胎齡23～28周54例，～30周8例，每例患兒在生后24 h內(nèi)獲取第1份氣道內(nèi)吸引物，對持續(xù)機械通氣患兒從生后第7 d起每周采樣1次?；虮磉_模式的時間序列分析具體步驟參考文獻[15]，顯著性閾值為P<0.01。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用R軟件 v 4.0.3(http://cran.r-project.org)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布或方差不齊的計量資料采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-WallisH檢驗。分類變量采用雙側(cè)Fisher確切概率法進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的RDS患兒581例，包括中期早產(chǎn)兒97例、極早產(chǎn)兒362例、超早產(chǎn)兒122例。表1顯示，匹配前BPD組224例，非BPD組357例，匹配前2組患兒除產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素治療比例、性別構(gòu)成比、氣胸發(fā)生率外，其余因素差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。匹配后BPD組111例，非BPD組157例，2組患兒除肺動脈高壓、動脈導(dǎo)管未閉、新生兒肺炎，侵入性通氣中有創(chuàng)機械通氣、高頻通氣比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，余因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 BPD組和非BPD組患兒的臨床特征比較[n (%)]

2.2 RDS并發(fā)BPD樣本中罕見變異顯著富集的相關(guān)生物學(xué)過程 基于2 742個背景基因顯著富集的1 558個生物學(xué)過程(P<0.01)，對其相關(guān)基因集進行罕見變異關(guān)聯(lián)分析。圖1A顯示，蛋白質(zhì)截斷變異最顯著富集的基因集與蛋白激酶活性有關(guān)(P=0.011)；BPD組中攜帶蛋白質(zhì)截斷變異的基因總數(shù)最多的是陽離子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(P=0.027，n=22)。圖1B顯示，錯義/非同義變異最顯著富集的基因集與生長發(fā)育的調(diào)節(jié)有關(guān)(P=0.001)。

2.3 RDS并發(fā)BPD候選風(fēng)險基因 表2顯示，對2 742個測序基因進行罕見變異關(guān)聯(lián)分析，在BPD組中26個基因的錯義/非同義罕見變異負(fù)荷顯著高于非BPD組(P<0.05)，為BPD候選風(fēng)險基因。其中3個基因(ARSB、B9D2和UVSSA)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)

表2 26個BPD候選風(fēng)險基因 (n)

2.4 RDS并發(fā)BPD候選風(fēng)險基因差異表達驗證 肺巨噬細(xì)胞的基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)，與無/輕度BPD的RDS患兒相比，ARSB在機械通氣7～21 d的重度BPD患兒中表達水平均顯著降低(P<0.001，圖2A)。時間序列方法分析發(fā)現(xiàn)，ARSB在無/輕度BPD的RDS患兒肺巨噬細(xì)胞中表達與通氣時間存在依賴性變化(圖2B)，且其表達在RDS發(fā)生1周后動態(tài)上調(diào)(P<0.01)，但在重度BPD患兒中未見明顯上調(diào)。

3 討論

本研究篩選并驗證了在RDS并發(fā)BPD患兒中，ARSB基因為較高的有害變異負(fù)荷基因，其在驗證數(shù)據(jù)中有獨特的表達模式，可作為RDS并發(fā)BPD尤其是重度BPD的遺傳風(fēng)險因素。

國內(nèi)外研究已從患兒和臨床護理角度闡述了多種臨床因素對于評估RDS預(yù)后的價值，其中比較明確的因素包括胎齡、出生體重、新生兒肺炎和機械通氣等[16-18]。在本研究中只匹配了胎齡進行后續(xù)的遺傳分析，一是因為胎齡[6,11,17]是所有BPD風(fēng)險因素研究中證實的高危因素，二是因為大部分BPD影響因素都與胎齡相關(guān)。匹配胎齡后BPD組 與非BPD組間肺動脈高壓、動脈導(dǎo)管未閉、新生兒肺炎、有創(chuàng)機械通氣、高頻通氣差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義，但其差異的顯著性均減小。而且本研究確定的BPD風(fēng)險基因中沒有報道與肺動脈高壓[19]和動脈導(dǎo)管未閉[20]有關(guān)，說明只匹配胎齡在一定程度上減弱了混雜因素對結(jié)果的影響。

基因集的罕見變異關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，BPD風(fēng)險基因集主要與蛋白激酶活性、陽離子通道和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)相關(guān)。最近，Elsaie等[21]通過小鼠實驗證明蛋白激酶AMPKα1可以減少高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD和肺動脈高壓的發(fā)生率，并促進人類肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生從而減弱肺損傷。一項研究[22]表明，陽離子通道Piezo1通過增加一氧化氮和鈣流入減少肺血管收縮可以減弱呼吸機誘導(dǎo)的肺損傷，促進Piezo1活性和表達，可能有助于治療RDS。Rozycki[23]也發(fā)現(xiàn)I型肺泡上皮細(xì)胞上的離子通道和轉(zhuǎn)運功能可能與肺損傷、修復(fù)以及BPD的發(fā)展有關(guān)。另外，肺部血管生長和發(fā)育與BPD的關(guān)系研究較為透徹[24]。以上研究均提示蛋白激酶、離子通道和生長發(fā)育相關(guān)基因的罕見變異對RDS患兒的轉(zhuǎn)歸有重要影響。

本研究從基因水平的罕見變異關(guān)聯(lián)分析篩選出26個BPD候選風(fēng)險基因，與既往3項BPD遺傳風(fēng)險的研究[7, 8, 25]相比，有4個基因(TBP、ACAN、SEC23B和LAMB2)曾被報道。以往罕見變異關(guān)聯(lián)研究多通過聲明顯著性較高的變異負(fù)荷或基因干擾實驗來驗證變異對基因的作用，但最近有研究使用大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集表明基因外顯子表達可納入對罕見變異的解釋[14]。本研究通過基因差異表達驗證，明確了高負(fù)荷罕見變異基因ARSB對RDS患兒預(yù)后的重要性，可作為BPD遺傳風(fēng)險基因。

ARSB相關(guān)的疾病包括黏多糖貯積癥，該病遺傳方式通常為常染色體隱性遺傳，由位于5號染色體(5q13-5q14)上的ARSB基因突變引起，臨床表現(xiàn)為肺功能降低[26]。目前已有研究[27]利用人類支氣管上皮細(xì)胞和小鼠模型證明ARSB的活性與低氧血癥有關(guān)。Seo等[28]隨訪331例慢性阻塞性肺疾病患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)ARSB的表達和SNPs與慢性阻塞性肺疾病患者對長期吸氧的反應(yīng)有關(guān)，SNPs是ARSB表達的定量性狀位點。一項有關(guān)囊性纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，ARSB與支氣管上皮細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)配體門控陰離子通道的功能有關(guān)[29]，而囊性纖維化與BPD患者往往具有相似的表型，在嬰兒期常有反復(fù)的呼吸道癥狀和/或發(fā)育不全[30]。這些證據(jù)表明，BPD患兒中ARSB較高的變異負(fù)荷可能干擾離子通道的穩(wěn)態(tài)，影響了RDS患兒對氧療的反應(yīng)。

本研究局限性：①研究對象為有遺傳風(fēng)險的RDS并發(fā)BPD人群，結(jié)論外推到其他人群應(yīng)謹(jǐn)慎；②基線數(shù)據(jù)中未包括患兒母親詳細(xì)的圍生期疾病史、患兒吸氧時間和吸氧濃度等BPD的高危因素；③RDS并發(fā)BPD遺傳風(fēng)險基因的驗證不是來自于本研究人群的驗證，而是來源于GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)驗證。

利益沖突聲明作者和文章內(nèi)容不存在商業(yè)或非商業(yè)資助利益沖突。