韓方，張熒，蒯顧平，任青玲，胡榮魁*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種育齡女性常見的異質(zhì)性生殖內(nèi)分泌綜合征，其在育齡女性中的發(fā)病率約為6%～19%[1]。PCOS以慢性無排卵(排卵功能紊亂或喪失)、高雄激素血癥和多囊卵巢為典型特征。PCOS患者常易發(fā)展為代謝綜合征，具體表現(xiàn)為胰島素抵抗、高胰島素血癥、腹型肥胖、高脂血癥[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗在PCOS患者中的發(fā)病率高達(dá)70%，是導(dǎo)致PCOS生殖、代謝異常的關(guān)鍵因素之[2-3]。

PCOS多歸屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)失調(diào)”“閉經(jīng)”“崩漏”“不孕”等疾病的范疇?！杜魄幸吩唬骸胺拾讒D人，經(jīng)閉而不通者，必是痰濕與脂膜壅塞之故也?！比f全在《萬氏婦人科》中提出：“惟彼肥碩者，膏脂充滿，元室之戶不開，挾痰者痰涎壅滯，血海之波不流，故有過期而經(jīng)始行，或數(shù)月經(jīng)一行，及為濁，為帶，為經(jīng)閉，為無子之病?！敝煺鸷嘣凇兜は姆ā分杏涊d：“若是肥盛婦人，稟受甚厚，恣于酒食之人，經(jīng)水不調(diào)，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰?！笨梢姽糯t(yī)家認(rèn)為PCOS多與痰濕有關(guān)。臨床橫斷面研究顯示，痰濕體質(zhì)者較非痰濕體質(zhì)者血糖、胰島素水平更高，更易出現(xiàn)胰島素抵抗[4]。胰島素抵抗導(dǎo)致的糖、脂代謝障礙又被證實(shí)是痰濕的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)之一，因而胰島素抵抗被認(rèn)為是痰濕形成的病理生理基礎(chǔ)[4-5]。

國醫(yī)大師夏桂成教授通過對多囊卵巢綜合征分型的長期研究，發(fā)現(xiàn)痰濕肥胖型多囊卵巢綜合征存在陰虛及陽者較多，這是因?yàn)楸静￠L期處于經(jīng)后期的狀態(tài)，陰虛陽弱甚至有陰無陽，陰虛則精卵不能成熟，不能順利陽長，陰不足則陽長欠盛，陽虛易致水濕內(nèi)停，釀生痰濕，進(jìn)而凝結(jié)為痰脂，導(dǎo)致肥胖。同時(shí)，陰陽轉(zhuǎn)化不利，氣血津液不能和暢，也易于釀生痰濕、甚至留瘀，從而導(dǎo)致多囊卵巢綜合征復(fù)雜的病理過程和多樣的病理產(chǎn)物。夏桂成教授主張治療痰濕閉經(jīng)應(yīng)從減肥、通經(jīng)、調(diào)周期方面入手, 認(rèn)為痰濁脂肪蘊(yùn)塞，大便秘結(jié)之肥胖，當(dāng)給予防風(fēng)通圣丸治療，以達(dá)到表里雙解、通腑泄熱的目的[6]。本研究采用來曲唑構(gòu)建胰島素抵抗型PCOS大鼠模型，觀察防風(fēng)通圣丸對胰島素抵抗型PCOS大鼠的療效并探查其可能的作用機(jī)理，為臨床使用防風(fēng)通圣丸治療胰島素抵抗型PCOS提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雌性21日齡SD大鼠20只，體質(zhì)量150～180 g，動(dòng)物許可證號：SCXK(浙)2019-0002，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。動(dòng)物入室后常規(guī)飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，自由飲水，12 h交替照明，室溫(22±3)℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

來曲唑(美國諾華制藥公司)；防風(fēng)通圣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)，藥物組成：防風(fēng)、荊芥穗、薄荷、麻黃、大黃、芒硝、梔子、滑石、桔梗、石膏、川芎、當(dāng)歸、白芍、黃芩、連翹、甘草、白術(shù)(炒)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

羧甲基纖維素(Sigma公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；蘇木素、伊紅染色液、游離自由脂肪酸檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；雌二醇、睪酮ELISA 檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；胰島素ELISA 檢測試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；V型膠原酶(Sigma公司)；胰島素受體β(anti-Insulin Receptor β，IRβ)抗體(SANTA CRUZ生物科技公司)；抗小鼠抗體(南京潤研生物科技有限公司)。Z326K型高速冷凍離心機(jī)(德國Hermle公司)；RM2235型切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；TEC-5-EMJ-2型石蠟包埋機(jī)(日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社)；1708265型ChemiDocXPS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，1703930型濕轉(zhuǎn)印槽，1658001型小垂直板電泳槽(美國Bio-Rad公司)；1510型全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物建模

21日齡雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對照組(6只)和模型組(14只)。模型組將芳香化酶抑制劑來曲唑(1.0 mg/kg)溶于1%羧甲基纖維素(2 mg/kg)中，每日灌胃，連續(xù)21 d，正常對照組則每日給予等量的0.5%羧甲基纖維素，連續(xù)21 d，于造模第12天開始每日陰道涂片，觀察各組大鼠動(dòng)情周期變化，連續(xù)10 d，成功誘導(dǎo)PCOS大鼠13只。

1.2.2 分組、給藥

13只PCOS大鼠隨機(jī)分為模型組(6只)、防風(fēng)通圣丸組(7只)。防風(fēng)通圣丸組按照人鼠體質(zhì)量比的1倍計(jì)算每日灌胃給藥劑量，連續(xù)14 d；正常對照組、模型組則每日灌服水，連續(xù)14 d。

1.2.3 血清激素水平測定

實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后，于干預(yù)末日20∶00開始禁食，次日8∶00腹腔注射10%水合氯醛麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血5 mL，離心血液標(biāo)本，取血清，按照試劑盒說明操作，ELISA法測定血清雌二醇、睪酮濃度。

1.2.4 血清糖、脂代謝指標(biāo)測定

全自動(dòng)生化分析儀檢測血糖、血脂(包括膽固醇、甘油三酯)濃度；微量法測定血清游離脂肪酸濃度；ELISA法測定血清胰島素濃度；計(jì)算胰島素抵抗(HOMA-IR)指數(shù)，HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。

1.2.5 卵巢組織病理形態(tài)檢測

留取右側(cè)卵巢組織，置于4%福爾馬林固定，蠟塊包埋，HE染色，顯微鏡觀察卵巢組織的病理學(xué)形態(tài)。

1.2.6 葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)

摘取胰腺，剪刀切碎胰腺，將胰腺置于0.5% V型膠原酶溶液中，37 ℃恒溫水浴中消化15 min, 10%胎牛血清終止消化，250×g4 ℃離心1 min，重復(fù)2次，顯微鏡下，挑出胰島。參照文獻(xiàn)[7-8]，將胰島在37 ℃和5% CO2的標(biāo)準(zhǔn)Krebs-Ringer碳酸氫鹽(KRB)溶液中預(yù)孵育1 h，然后在補(bǔ)充有3.3 mmol/L葡萄糖的KRB中洗滌、孵育1 h，隨后用含有16.7 mmol/L葡萄糖的KRB中孵育1 h。每次處理后收集上清液，ELISA法測定上清胰島素濃度。

1.2.7 Western blotting測定骨骼肌(比目魚肌)IRβ蛋白水平

按照蛋白裂解液提取試劑盒說明書要求提取各組比目魚肌總蛋白，按比例加入裂解液后置于勻漿機(jī)研磨，隨后置碎冰上裂解1 h，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測各組蛋白濃度。取各組30 μg蛋白上樣，電泳，濃縮膠電壓70 V，分離膠90 V。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗稀釋液(抗IRβ1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，曝光。使用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析灰度值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 20.0軟件處理，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，進(jìn)行單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Kueuls檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、性腺旁脂肪組織重量檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠體質(zhì)量、性腺旁脂肪重量顯著高于正常對照組(P<0.05)；防風(fēng)通圣丸組體質(zhì)量、性腺旁脂肪重量顯著低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束體質(zhì)量、性腺旁脂肪組織重量比較

2.2 血清性激素水平檢測

模型組血清雌二醇水平較正常對照組顯著降低(P<0.05)，防風(fēng)通圣丸組血清雌二醇水平較模型組顯著升高(P<0.05)；模型組血清睪酮水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，防風(fēng)通圣丸組血清睪酮水平較模型組顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下正常對照組見黃體和處于不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞約9～16層，排列整齊、緊密，卵泡內(nèi)見放射冠以及卵母細(xì)胞(圖1A)；模型組見黃體和多個(gè)囊性擴(kuò)張的卵泡，卵泡體積增大，卵泡中卵母細(xì)胞或放射冠消失，顆粒細(xì)胞極薄約2～4層，排列疏松(圖1B)；防風(fēng)通圣丸組黃體及處于不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)量介于正常對照組和模型組之間, 部分卵泡內(nèi)可見卵母細(xì)胞、放射冠，顆粒細(xì)胞增厚約為8～10層，排列較緊密(圖1C)。

圖1 卵巢組織學(xué)圖片( HE，×400)

2.4 糖代謝、脂代謝水平檢測

模型組空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)、膽固醇、甘油三酯、自由脂肪酸較正常對照組顯著升高(P<0.05)，防風(fēng)通圣丸組空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)、膽固醇、甘油三酯、自由脂肪酸較模型組顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠糖代謝與脂代謝水平比較

2.5 葡萄糖刺激胰島分泌胰島素實(shí)驗(yàn)

模型組3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰島分泌胰島素較正常對照組顯著升高(P<0.05)，防風(fēng)通圣丸組3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰島分泌胰島素PCOS 模型組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠葡萄糖刺激胰島分泌胰島素比較

2.6 骨骼肌(比目魚肌)IRβ蛋白水平

模型組比目魚肌IRβ蛋白水平較正常對照組顯著降低(P<0.05)，防風(fēng)通圣丸組比目魚肌IRβ蛋白水平較模型組顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2。

注：A.蛋白條帶圖；B.蛋白相對表達(dá)量圖。C.正常對照組；M.模型組；F.防風(fēng)通圣丸組。與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖2 各組大鼠比目魚肌IR-蛋白條帶圖及水平比較

3 討論

防風(fēng)通圣丸是金元四大家之一劉完素創(chuàng)立的名方，出自《黃帝素問·宣明論方》，由防風(fēng)、荊芥、薄荷、麻黃、大黃、芒硝、梔子、滑石、桔梗、石膏、川芎、當(dāng)歸、白芍、黃芩、連翹、甘草、白術(shù)共17 味中藥組成。本方集汗下清補(bǔ)于一方, 分消表里邪熱, 兼顧氣血, 驅(qū)邪而不傷正，具有通里解表、清熱解毒的功效。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，經(jīng)防風(fēng)通圣丸治療的胰島素抵抗型PCOS大鼠，胰島素抵抗明顯改善，空腹血糖、胰島素水平及HOMA-IR指數(shù)顯著降低。外周靶組織的胰島素作用受損(即外周胰島素抵抗) 、胰島素分泌缺陷是導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制。骨骼肌是影響機(jī)體糖代謝的主要器官之一，其承擔(dān)了機(jī)體85%由胰島素刺激引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。因此，骨骼肌作為胰島素作用的主要靶器官，在胰島素抵抗的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。骨骼肌中IR-β是葡萄糖的主要利用者，在維持機(jī)體葡萄糖水平中起關(guān)鍵作用。胰島素受體為酪氨酸蛋白激酶型受體，由IR-α和IR-β亞單位組成，胰島素與IR-α結(jié)合后，引起IR-β的酪氨酸磷酸化，并在胰島素受體底物的參與下，激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K在骨骼肌細(xì)胞中促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4移位到細(xì)胞膜上，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取[10]。研究顯示肥胖、Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌IR-β蛋白水平降低[10-11]。MISHRA等[8]研究顯示二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)誘導(dǎo)的胰島素抵抗型PCOS大鼠骨骼肌IR-β蛋白水平降低。本研究顯示，PCOS模型大鼠比目魚肌IR-β蛋白水平降低，經(jīng)防風(fēng)通圣丸治療后目魚肌IR-β蛋白水平上調(diào)。此外，本研究顯示模型組分離的胰島表現(xiàn)出葡萄糖刺激的胰島素分泌較正常大鼠的胰島增加，表明來自模型組的胰島產(chǎn)生更高水平的胰島素。而從防風(fēng)通圣丸組分離的胰島表現(xiàn)出葡萄糖刺激的胰島素分泌較模型組分離的胰島降低，表明來自防風(fēng)通圣丸組的胰島分泌胰島素缺陷改善。

胰島素抵抗是導(dǎo)致PCOS患者生殖、代謝異常發(fā)病機(jī)制的核心組成部分。胰島素通過胰島素樣生長因子-1受體介導(dǎo)，刺激卵巢產(chǎn)生雄激素，雄激素升高阻礙卵泡發(fā)育并誘導(dǎo)其在成熟前閉鎖，維持持續(xù)無排卵狀態(tài)，卵巢內(nèi)升高的雄激素抑制芳香化酶活性，阻礙雌激素生成。血清高胰島素血癥還可通過減少肝臟SHBG的合成，導(dǎo)致游離睪酮含量增加，從而導(dǎo)致PCOS的高雄激素血癥。高雄激素血癥導(dǎo)致脂肪細(xì)胞功能失調(diào)，進(jìn)一步影響糖、脂質(zhì)代謝和卵泡生長發(fā)育。胰島素通過抑制脂肪組織釋放自由脂肪酸調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化代謝，胰島素抵抗患者的這種抑制作用被打破，導(dǎo)致血液中自由脂肪酸增多，流經(jīng)肝臟的自由脂肪酸增多，加速甘油三酯合成[12-13]。本研究顯示防風(fēng)通圣丸可明顯降低胰島素抵抗型PCOS大鼠的睪酮水平，提升PCOS大鼠雌二醇水平，并改善PCOS大鼠脂代謝及卵泡生長發(fā)育。

綜上所述，防風(fēng)通圣丸能夠改善胰島素抵抗型PCOS模型大鼠糖、脂代謝異常，調(diào)控機(jī)體性激素水平，起到治療PCOS生殖、代謝異常作用，其改善PCOS胰島素抵抗分子機(jī)制為提高骨骼肌IR-β蛋白水平、降低葡萄糖刺激胰島分泌胰島素。