王婷，黃磊，呂新月，李濱汐，韓建剛，李胎花*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037； 2. 江蘇洪澤湖濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測(cè)研究站，洪澤 223100； 3. 南京國環(huán)科技股份有限公司，南京 210018)

真菌毒素是由曲霉屬(Asperillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)有毒代謝產(chǎn)物，常見的主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素等[1-3]。其中，赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素系列中分布最廣、毒性最強(qiáng)、產(chǎn)毒量和危害最大的真菌毒素。研究表明，OTA不僅對(duì)人類和動(dòng)物具有致畸、致癌、致突變及免疫抑制作用，還具有腎毒性、肝毒性和神經(jīng)毒性[4-5]。由于OTA是一種化學(xué)穩(wěn)定和熱穩(wěn)定的化合物，能夠承受現(xiàn)代食品加工的物理化學(xué)條件，可以在宿主真菌根除后存活，且能夠通過食物鏈在人體內(nèi)富集，在人體中有較長的半衰期，約為35 d[6]。有數(shù)據(jù)顯示，全球每年約25%的食物受到真菌毒素不同程度的污染，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。鑒于OTA對(duì)人類健康的巨大危害及造成的經(jīng)濟(jì)損失，有必要開發(fā)可靠的方法來檢測(cè)真菌毒素。目前，OTA的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫分析法(FIA)等[8-10]；因此，充分認(rèn)識(shí)OTA的光學(xué)性質(zhì)可為開發(fā)OTA的檢測(cè)方法提供新的依據(jù)。

由于OTA結(jié)構(gòu)式中苯丙氨酸部分的羧基和異香豆素部分的酚羥基，OTA的解離常數(shù)(pKa)范圍分別為4.2～4.4和7.0～7.3。在弱酸性溶液中和弱堿性溶液中，OTA分別以單陰離子(OTA-)和雙陰離子(OTA2-)形式存在，對(duì)應(yīng)的最大吸收峰分別為波長330和380 nm，而熒光發(fā)射波長均為450 nm；因此，OTA的吸光度和熒光性質(zhì)取決于其結(jié)構(gòu)式中苯的丙氨酸羧基和酚羥基的去質(zhì)子化狀態(tài)[11]。此外，有很多因素影響OTA的去質(zhì)子化，如陽離子鹽、pH、蛋白質(zhì)和陽離子表面活性劑等[10-13]。近年來，研究人員不斷地深入了解關(guān)于表面活性劑及反應(yīng)體系酸堿度在熒光分析中的作用機(jī)理及規(guī)律性[14-15]。盡管表面活性劑和酸堿度對(duì)OTA本身熒光的影響方面已有研究[13]，但目前為止，人們對(duì)不同陽離子型表面活性劑對(duì)OTA光學(xué)性質(zhì)的影響尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。

聚乙烯亞胺(PEI)是具有單陽離子、雙陽離子和三陽離子3種形態(tài)的陽離子型表面活性劑，帶有很高的正電荷，PEI及其改性物具有固定陰離子性物質(zhì)的作用[16]。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為季銨鹽型陽離子表面活性劑，具有水溶性好、耐酸堿和抗菌功效的特性，在其非極性區(qū)域含有正電荷[17]。聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)是一種高分子聚季銨鹽，具有正電荷密度高、結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定且無毒等特點(diǎn)[18]。因此，筆者探討了在不同酸堿度條件下的3種陽離子型表面活性劑PEI、CTAB和PDDA對(duì)OTA熒光性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

OTA(分析純)和CTAB(相對(duì)分子質(zhì)量62 000，純度≥99%)，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；PEI(相對(duì)分子質(zhì)量10 000，純度99%)和PDDA(相對(duì)分子質(zhì)量100 000～200 000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，自制。實(shí)驗(yàn)中的OTA溶于甲醇。

分別選用pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0，9.0和10.0的緩沖溶液(20 mmol/L)。其中，pH 3.0，4.0 和5.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；pH 6.0為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液；pH 7.0為磷酸鹽緩沖溶液；pH 7.4為3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)緩沖溶液；pH 8.0為硼酸-硼砂緩沖溶液；pH 9.0和10.0為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。

LS55型熒光分光光度計(jì)和365型紫外/可見光分光光度計(jì)，美國PerkinElmer公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH對(duì)OTA熒光性質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)

將溶于甲醇的OTA在不同pH的緩沖溶液中定容，使反應(yīng)體系中OTA的濃度為100 nmol/L(甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%)。將溶液混勻后，常溫靜置反應(yīng)10 min，然后使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定體系溶液的熒光光譜，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。熒光發(fā)射波長為450 nm，狹縫寬度設(shè)定為6 nm×6 nm。

1.2.2 陽離子表面活性劑對(duì)OTA熒光性質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)

將OTA分別加入到含PEI、CTAB、PDDA的pH 6.0，7.4和9.0緩沖溶液(10 mmol/L)中定容，使反應(yīng)體系中OTA的濃度為100 nmol/L，PEI、CTAB和PDDA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%。將溶液混勻反應(yīng)10 min，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定體系溶液的熒光光譜；在pH 6.0緩沖溶液中，100 nmol/L濃度的OTA分別與相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度(0，0.001%，0.005%，0.010%和0.020%)的PEI、CTAB和PDDA混合后，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定體系溶液的熒光光譜。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。熒光發(fā)射波長均為450 nm，狹縫寬度設(shè)定為6 nm×6 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin 2018軟件處理作圖。

圖2 OTA在不同pH緩沖溶液中的激發(fā)光譜圖和各pH對(duì)應(yīng)的340和390 nm處的熒光強(qiáng)度圖Fig. 2 Fluorescence excitation spectra of OTA in buffers at different pH values and fluorescence intensities at 340 and 390 nm

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)OTA吸光度和熒光性質(zhì)的影響

為了探究pH對(duì)OTA光學(xué)性質(zhì)的影響，利用紫外可見光分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)分別對(duì)OTA的吸光度和熒光性質(zhì)進(jìn)行了分析。紫外可見光分光光度計(jì)掃描4種體系溶液中OTA的吸光光譜見圖1。OTA在酸性(pH 4.0)、中性(pH 7.0)和堿性(pH 10.0)的緩沖溶液中，吸收帶分別集中在波長330，380，380 nm，且在甲醇溶液中330 nm處的吸收帶遠(yuǎn)大于380 nm處。這主要?dú)w因于OTA包含芳香族發(fā)色團(tuán)/其他有機(jī)化合物，通常在紫外可見光光譜中顯示出強(qiáng)吸收，尤其在紫外區(qū)。波長330和380 nm處分別對(duì)應(yīng)OTA的質(zhì)子化和去質(zhì)子化狀態(tài)，即單陰離子(OTA-)和雙陰離子(OTA2-)[11,13,19]。結(jié)果表明，在酸性溶液中，完全質(zhì)子化的OTA占主導(dǎo)地位。這歸因于在酸性溶液中OTA的羧基pKa值(4.2～4.4)低于酚羥基pKa值(7.0～7.3)，所以羧基比酚羥基優(yōu)先電離，此時(shí)OTA以O(shè)TA-形態(tài)存在。在甲醇溶液中，完全質(zhì)子化的OTA占主導(dǎo)地位，這是由于OTA和甲醇之間特定的溶質(zhì)-溶劑相互作用(主要是氫鍵)。在堿性溶液中，羧基和酚羥基完全電離，此時(shí)完全去質(zhì)子化的OTA2-占主導(dǎo)地位。由于OTA中酸性官能團(tuán)的羧基的影響，OTA在中性溶液以O(shè)TA-和OTA2-形態(tài)共存[11,13,20]。

圖1 在甲醇、緩沖溶液中OTA的紫外可見光光譜圖Fig. 1 UV-Vis spectra of OTA in methanol and buffer solutions at different pH values

OTA在溶液中的熒光性質(zhì)主要取決于其質(zhì)子化和去質(zhì)子化狀態(tài)。為了考察OTA在不同pH條件下的熒光性質(zhì)，利用pH 3.0～10.0的緩沖溶液，設(shè)置發(fā)射波長為450 nm，對(duì)其緩沖溶液中的OTA進(jìn)行了熒光檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在pH 3.0～6.0的緩沖體系溶液中，在340 nm處有明顯的熒光波峰，表明在酸性條件下OTA主要以O(shè)TA-形態(tài)存在，隨pH的增大，340 nm處的熒光強(qiáng)度略有下降，但變化不明顯；在pH 7.4的緩沖體系溶液中，340和390 nm處均出現(xiàn)熒光波峰，說明OTA-和OTA2-共存，且OTA2-略占優(yōu)勢(shì)；在pH 8.0～10.0的緩沖體系溶液中，390 nm處有明顯的熒光波峰，表明OTA2-占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。隨pH的增大，390 nm處的波峰也逐漸升高，pH 9.0時(shí)OTA的熒光強(qiáng)度最大。這主要?dú)w因于OTA在不同酸堿度溶液中的解離常數(shù)，在酸性溶液中羧基先去質(zhì)子化，隨pH的增大，酚羥基也進(jìn)行去質(zhì)子化，促使OTA-向OTA2-轉(zhuǎn)變[11,13]。由圖2可見，OTA在pH 6.0，7.4和9.0的緩沖溶液中表現(xiàn)出不同的熒光特性，所以選用這3種pH的緩沖溶液探究了表面活性劑對(duì)OTA的熒光性質(zhì)的影響。

2.2 陽離子型表面活性劑對(duì)OTA熒光性質(zhì)的影響

為了研究陽離子型表面活性劑對(duì)OTA熒光性質(zhì)的影響，選取了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的3種不同結(jié)構(gòu)特征的PEI、CTAB和PDDA，在pH 6.0，7.4和9.0的緩沖溶液中與無表面活性劑的緩沖溶液對(duì)比進(jìn)行了探究，結(jié)果如圖3和4所示。固定發(fā)射波長450 nm進(jìn)行掃描，在無表面活性劑的pH 6.0弱酸性環(huán)境中，OTA主要以O(shè)TA-形態(tài)存在；在pH 7.4中性環(huán)境中，OTA以O(shè)TA-和OTA2-形態(tài)存在；在弱堿性環(huán)境中，OTA主要以O(shè)TA2-形態(tài)存在。結(jié)果表明：在酸性條件下，OTA僅羧基會(huì)電離；在中性條件下，部分酚羥基也開始電離；在堿性條件下，羧基和酚羥基完全電離，促使OTA完全去質(zhì)子化。與無表面活性劑相比，陽離子型表面活性劑對(duì)OTA的熒光特性具有顯著的影響，尤其在弱酸性pH 6.0和中性pH 7.4環(huán)境中。由于不同陽離子表面活性劑的結(jié)構(gòu)不同，所帶正電荷量的差異，PEI、CTAB和PDDA與OTA分別呈現(xiàn)出了不同的熒光特性，并且呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性(圖3)。在pH 6.0和7.4時(shí)，加入PEI、CTAB或者PDDA后，390 nm處吸收峰都明顯增強(qiáng)，說明陽離子表面活性劑促進(jìn)了OTA由單陰離子OTA-狀態(tài)向雙陰離子OTA2-轉(zhuǎn)變，而且在pH 7.4時(shí)，3種表面活性劑均完全促使OTA去質(zhì)子化為OTA2-(圖4)。在pH 6.0時(shí)，PEI/OTA與CTAB/OTA、PDDA/OTA相比，促使OTA-完全去質(zhì)子化而轉(zhuǎn)化為OTA2-，其對(duì)應(yīng)波峰390 nm處發(fā)生了明顯升高，這是由于PEI的結(jié)構(gòu)上富含胺基，促使OTA-中的酚羥基發(fā)生去質(zhì)子化作用。在pH 9.0時(shí)，相比同濃度的PEI和PDDA，CTAB/OTA2-的波峰明顯低于前兩者。這可能是低濃度的CTAB會(huì)對(duì)OTA的溶解性產(chǎn)生一定的影響，使OTA在溶液中的溶解度降低。而且在3種pH緩沖溶液中，OTA與CTAB共存時(shí)，均出現(xiàn)OTA2-的波峰右移的現(xiàn)象。

圖3 不同陽離子型表面活性劑存在于不同pH緩沖溶液中時(shí)OTA的激發(fā)光譜圖Fig. 3 Fluorescence excitation spectra of OTA in buffers at different pH values in the absence and presence of cationic surfactants

圖4 不同表面活性劑存在于不同pH緩沖溶液中時(shí)340和390 nm處OTA的熒光強(qiáng)度柱狀分析圖Fig. 4 Fluorescence intensities of OTA at 340 and 390 nm in buffers at different pH values in the absence and presence of cationic surfactants

為了進(jìn)一步考察在pH 6.0弱酸性環(huán)境中不同濃度的PEI、CTAB、PDDA對(duì)OTA的去質(zhì)子化影響，對(duì)3種陽離子型表面活性劑各設(shè)置了相同濃度梯度進(jìn)行了熒光檢測(cè)，結(jié)果如圖5和圖6所示。當(dāng)加入PEI后，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.001%～0.020%，在340 nm處的波峰均消失，且390 nm處的波峰隨PEI質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而升高，說明極少量的PEI也會(huì)使OTA-完全去質(zhì)子化為OTA2-(圖5a)。相比PEI，CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.02%范圍內(nèi)，隨CTAB質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，340 nm處的波峰逐漸降低；相反，390 nm處的波峰逐漸升高，且CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.01%時(shí)，會(huì)使OTA-完全向OTA2-轉(zhuǎn)化(圖5b和圖6)。而在體系溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～0.02%的PDDA時(shí)，340和390 nm處均有波峰，隨著PDDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，340 nm處的波峰略有下降的趨勢(shì)，但下降程度不明顯，而390 nm處的波峰逐漸增大(圖5c和圖6)。由此可知，在酸性條件下，PDDA能夠促進(jìn)OTA-向OTA2-轉(zhuǎn)變，但不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺TA2-，而PEI和CTAB在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，均可促使OTA-完全向OTA2-轉(zhuǎn)變。這可能是由于PDDA的正電荷性比PEI和CTAB弱，導(dǎo)致OTA的酚羥基在酸性條件下不能完全去質(zhì)子化，此時(shí)OTA以O(shè)TA-和OTA2-形態(tài)共存。

圖5 不同濃度的PEI、CTAB、PDDA存在于pH 6.0緩沖溶液中時(shí)OTA的激發(fā)光譜圖Fig. 5 Fluorescence spectra of OTA in pH 6.0 buffered solutions with different cationic surfactants

圖6 不同濃度表面活性劑存在于pH 6.0緩沖溶液中時(shí)OTA在340和390 nm的熒光強(qiáng)度分析Fig. 6 Fluorescence intensities of OTA at 340 and 390 nm in pH 6.0 buffers with cationic surfactants at different concentrations

3 結(jié) 論

選用3種陽離子型表面活性劑探討了它們?cè)诓煌琾H環(huán)境中對(duì)OTA的去質(zhì)子化和熒光性質(zhì)的影響，具體結(jié)論如下：

1)pH、陽離子型表面活性劑及它們結(jié)合的微環(huán)境均可改變OTA的熒光強(qiáng)度和最大波峰位置，對(duì)OTA的熒光性質(zhì)均具有顯著的影響。OTA在酸性、中性和堿性環(huán)境中存在的形態(tài)分別是：OTA-、OTA2-、OTA2-。

2)與無表面活性劑相比，在不同酸堿度緩沖溶液中3種陽離子型表面活性劑PEI、CTAB、PDDA對(duì)OTA熒光性質(zhì)的影響有明顯差異。在酸性溶液中，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEI和CTAB均可使OTA-完全轉(zhuǎn)化為OTA2-，而PDDA使OTA以O(shè)TA-和OTA2-共存；在中性條件下，3種表面活性劑均會(huì)促使OTA形態(tài)由OTA-完全向OTA2-轉(zhuǎn)化。此外，在含有CTAB的3種酸堿度緩沖溶液中，OTA的波峰均出現(xiàn)右移的現(xiàn)象。

研究結(jié)果有利于了解OTA在不同微環(huán)境中的熒光性質(zhì)，也為建立OTA的熒光分析方法提供了良好的思路與依據(jù)。