王燕波 胡陽(yáng) 宋寧 賈守杰 魏存樂 丁衛(wèi)民

肺結(jié)核是嚴(yán)重影響人民身體健康的傳染性疾病，已成為嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。肺結(jié)核(肺臟、氣管支氣管及胸膜結(jié)核)雖為臨床常見病、多發(fā)病，但因臨床上近幾年來(lái)對(duì)結(jié)核病的忽視，加之菌陰結(jié)核病大量存在，肺結(jié)核多被誤診誤治，明確診斷時(shí)多已為重癥結(jié)核[2]。支氣管鏡可以直接觀察氣道局部病變，并通過(guò)活檢、刷檢、沖洗、灌洗等，取得氣道肺標(biāo)本，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)、病理學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)，對(duì)肺結(jié)核尤其是菌陰結(jié)核確診，提供了幫助[3]。為探討支氣管鏡在菌陰肺結(jié)核臨床診斷價(jià)值，本次研究對(duì)我院862例菌陰肺結(jié)核患者，進(jìn)行了回顧性分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2020年12月大同市第四人民醫(yī)院862例菌陰肺結(jié)核患者作為本次研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，其中男性332例，占比38.52%，女性530例，占比61.48%，患者年齡18～60歲，平均年齡(42.5±3.3)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2021003)，所有患者均簽署知情同意書。

菌陰肺結(jié)核診斷參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4]：①典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn)；②抗結(jié)核治療有效；③臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾患；④PPD(5iu)強(qiáng)陽(yáng)性、血清結(jié)核抗體陽(yáng)性；⑤痰結(jié)核分枝桿菌PCR +探針檢測(cè)陽(yáng)性；⑥肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變；⑦BALF檢出抗酸菌；⑧支氣管或肺組織病理證實(shí)結(jié)核病變。具備1～6中3項(xiàng)，或7～8中任何一項(xiàng)可確診。除外氣管支氣管結(jié)核及結(jié)核性胸膜炎。

二、標(biāo)本留取及檢測(cè)方法

1.標(biāo)本留?。孩?痰液留?。虹R檢前及鏡檢后當(dāng)時(shí)囑患者進(jìn)行深呼吸，并盡量收集其由肺部深處咳出分泌物。②電子支氣管鏡檢查及取樣：使用潘太克斯EB-1975K型及奧林巴斯290系列支氣管鏡進(jìn)行支氣管鏡檢查。針對(duì)肺部病灶部位進(jìn)行沖洗檢查，取得沖洗液標(biāo)本。

2.檢測(cè)方法：沖洗液離心后分別行抗酸染色鏡檢找抗酸桿菌、結(jié)核分枝桿菌BD-960快速培養(yǎng)、羅氏培養(yǎng)及藥敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain等檢測(cè)[4]。

(1)抗酸染色

①初染：用玻片夾，夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3～5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。②脫色：3%鹽酸酒精脫色30秒～1分鐘；用水沖洗。③復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。

(2)BD-960快速培養(yǎng)

標(biāo)本接種前 ，在MGIT培養(yǎng)管中先加入 0.8mL MGIT PANTA /Growth Supplement(雜菌抑制劑 /生長(zhǎng)添加劑)，再加入 0.5 mL處理后懸濁液，同時(shí)接種血平板(檢測(cè)是否污染)、直接涂片抗酸染色(以便陽(yáng)性快速報(bào)告)，將培養(yǎng)管放入 BD BACTECTMMGITTM960儀。培養(yǎng)法嚴(yán)格按照 BD BACTECTMMGITTM960 系統(tǒng)操作說(shuō)明書進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42d。儀器提示陽(yáng)性結(jié)果，取培養(yǎng)液涂片用快速抗酸染色法進(jìn)行確認(rèn)?？顾崛旧?yáng)性的菌株用熒光PCR 技術(shù)鑒定是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。儀器提示陽(yáng)性結(jié)果，涂片抗酸染色鏡檢未找到抗酸桿菌，將此分枝桿菌培養(yǎng)的標(biāo)本接種在血平板、麥康凱平板、沙氏平板、真菌顯色平板，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)，有革蘭陰性桿菌或真菌生長(zhǎng)，此情況為標(biāo)本污染判為假陽(yáng)性。所有接種和其他處理步驟都應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，使用生物安全水平為 Ⅱ 級(jí)的接種方法、防護(hù)措施和設(shè)備。所有接種過(guò)的培養(yǎng)管等必須先經(jīng)過(guò)高壓滅菌后再按醫(yī)療垃圾處理。

(3)羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

采集沖洗液標(biāo)本，采取酸性改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采取NaOH(3%)前處理，3倍體積處理液置于無(wú)菌痰杯，沖洗液充分液化，于20 min內(nèi)接種兩支羅氏培養(yǎng)基。再通過(guò)純菌按高低兩個(gè)藥物濃度做藥敏實(shí)驗(yàn)；采用絕對(duì)濃度間接法，并設(shè)對(duì)照管和對(duì)硝基苯甲酸(PNB)，α-羧酸肼噻吩(TCH)進(jìn)行菌型鑒定；所用藥敏濃度：異煙肼(H)分別為1和10μg/mL、利福平(R)分別為50和250μg/mL、鏈霉素(S)分別為20和200μg/mL、吡嗪酰胺(Z)分別為25和100μg/mL、乙胺丁醇(E)分別為5和50μg/mL、利福噴丁(RFT)為50和250μg/mL、對(duì)氨基水楊酸鈉(P)分別為1和10μg/mL、氧氟沙星(OFLX)分別為5和50μg/mL、丁胺卡那(AK)分別為10和100μg/mL、丙硫異煙胺(TH)分別為25和100μg/mL、對(duì)氨基水楊酸異煙肼(PI)分別為1和10μg/mL、卷曲霉素(C)分別為100和1000μg/mL。菌液濃度為10-2取0.1mL接種培養(yǎng)基上，(35±1)℃培養(yǎng)四周報(bào)告。

(4)PCR-TB-DNA

取無(wú)菌灌洗沖洗瓶采集每位研究對(duì)象支氣管肺泡沖洗液5 mL，密閉處理立即送檢，通過(guò)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)本內(nèi)加入等體積NaOH(4%)混合搖勻，在室溫條件下放置30 min，取液化后標(biāo)本1 mL置于離心管內(nèi)，離心處理(12 000r/min，5 min)，去除上清液，置入1mL無(wú)菌生理鹽水，洗滌，離心處理(12000r/min，5 min)，放入核酸提取儀，通過(guò)最大轉(zhuǎn)速震蕩5 min，在95℃熱水中熱浴5 min，離心處理(5000 r/min，1 min)，取上清液，通過(guò)博奧生物集團(tuán)有限公司結(jié)核分酸檢測(cè)試劑盒操作執(zhí)行。

三、結(jié)核桿菌培養(yǎng)

(1)X-pert

取痰液標(biāo)本加入2 mL處理液內(nèi)，置于渦旋振蕩器上混合均勻孵育15 min，取處理液加入反應(yīng)盒內(nèi)，置于GeneX-pert檢測(cè)模塊內(nèi)，2 h后判斷檢測(cè)結(jié)果。

(2)Hain檢測(cè)

指導(dǎo)患者深吸氣后用力咳出氣管深處痰液置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，依據(jù)中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)制定的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)痰標(biāo)本實(shí)施接種培養(yǎng)，將接種后痰標(biāo)本消化液采取Geno Type MTBDRplus檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Hain MTBDRplus公司)進(jìn)行檢測(cè)。

四、觀察指標(biāo)

對(duì)比862例菌陰肺結(jié)核患者在不同方法下抗酸桿菌及結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)檢測(cè)情況(見表1)。

表1 862例患者不同方法分枝桿菌相關(guān)檢測(cè)情況[n(%)]

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組患者不同方法抗酸桿菌及結(jié)核分枝桿菌相關(guān)檢測(cè)情況，如(表2)所示：支氣管鏡檢前后痰液及沖洗液標(biāo)本抗酸染色陽(yáng)性率分別為0.00 %(0/862)、6.15 % (53/862)及 12.18%(105/862)，三者之間有顯著性差異(P<0.05)；沖洗液BD-960快速培養(yǎng)、羅氏培養(yǎng)及藥敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain檢測(cè)陽(yáng)性率分別為：25.17 %(217/862)、26.57%(229/862)、42.69%(368/862)、52.32%(451/862)及47.45%(409/862)，分別與鏡檢前傳統(tǒng)痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性率比較均有顯著性差異(P<0.05)；支氣管沖洗液抗酸染色聯(lián)合BD-960快速培養(yǎng)、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率高達(dá)65.89%(568/862)，分別與鏡檢前后傳統(tǒng)痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性率比較均有顯著性差異(P<0.05)。支氣管沖洗液抗酸染色聯(lián)合BD-960快速培養(yǎng)、羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率為(33.76%，291/862)低于支氣管沖洗液PCR-TB-DNA、X-pert、Hain陽(yáng)性率(59.19%，509/862)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，451例沖洗液Xpert陽(yáng)性的標(biāo)本中，存在rpoB基因突變的有83例，突變率為18.40%；409例沖洗液Hain陽(yáng)性的標(biāo)本中，檢測(cè)到異煙肼耐藥的有79例，突變率為19.32%(見表3)。

表2 862例患者結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)與分子生物學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率比較

表3 X-pert及Hain陽(yáng)性患者基因突變情況[n(%)]

討 論

結(jié)核病作為一種慢性傳染疾病，嚴(yán)重的影響著人們的身體健康和生活質(zhì)量水平，我國(guó)是結(jié)核病發(fā)病率較高國(guó)家之一[5]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是控制結(jié)核病、阻斷結(jié)核病傳播的重要措施。有研究表明[6]，菌陰肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的60%，如果痰菌陰性肺結(jié)核患者不能得到有效的治療，會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為痰菌陽(yáng)性肺結(jié)核疾病，從而造成更多的人群患上肺結(jié)核疾病。以往臨床上對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)不全、檢查手段的局限性，導(dǎo)致臨床上大量漏診、誤診的現(xiàn)象發(fā)生，因此如何有效的對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行疾病的確診具有十分重要的臨床意義[7]。

當(dāng)前臨床多通過(guò)痰涂片和痰培養(yǎng)診斷肺結(jié)核，具有操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，但敏感性與特異性較低。而電子支氣管鏡檢查不僅能夠直觀的觀察氣道黏膜情況，且能夠通過(guò)對(duì)肺部病灶所在的支氣管進(jìn)行肺泡沖洗、支氣管沖洗等檢查，聯(lián)合相關(guān)檢測(cè)能提高肺結(jié)核的診斷率。其中肺泡沖洗可有效的增加對(duì)病灶的接觸面，同時(shí)生理鹽水的注入還會(huì)對(duì)支氣管產(chǎn)生一定的刺激性，導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的咳嗽，可能會(huì)讓深部結(jié)核桿菌被咳出得以回收，從而提高沖洗液相關(guān)檢測(cè)的陽(yáng)性率[8]。本研究，支氣管鏡檢查前痰涂片抗酸染色陽(yáng)性率為0%，通過(guò)支氣管鏡檢查等刺激后，鏡檢后痰涂片抗酸染色陽(yáng)性率明顯升高，而支氣管鏡沖洗檢查陽(yáng)性率更高(12.18%)，沖洗與既往國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論相一致[9-10]。此外，通過(guò)肺泡沖洗液進(jìn)行抗酸染色檢查、PCR、X-pert、Hain等綜合診斷，可將陽(yáng)性率提高至65.89%，顯著高于普通痰涂片檢查(P<0.001)，提示支氣管鏡檢查聯(lián)合檢測(cè)方式，可提高菌陰肺結(jié)核確診率。本研究還發(fā)現(xiàn)，所有分子檢測(cè)手段(PCR、X-pert、Hain)綜合陽(yáng)性率顯著高于所有病原學(xué)檢測(cè)綜合(抗酸染色、快培、羅培)。同時(shí)結(jié)合X-pert及Hain檢測(cè)陽(yáng)性患者中突變的檢出情況，顯示分子檢測(cè)手段在結(jié)核病的診斷甚至治療中，起到了更加重要的作用，因此應(yīng)重視分子檢測(cè)手段在結(jié)核病特別是菌陰肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)積極加以推廣。

菌陰肺結(jié)核診斷率不高的因素有很多，其中不僅與肺結(jié)核患者的病變類型，如血行播散型肺結(jié)核等，還與痰標(biāo)本留取、運(yùn)輸，甚至檢測(cè)人員的技術(shù)等，甚至與肺結(jié)核不同檢測(cè)技術(shù)本身的局限性等均有關(guān)。通過(guò)將上述不同因素進(jìn)行完善改進(jìn)，同時(shí)利用本研究中支氣管鏡診斷技術(shù)同時(shí)聯(lián)合多種不同檢測(cè)方式，可明顯提高菌陰肺結(jié)核患者的診斷率。因此支氣管鏡技術(shù)應(yīng)在肺結(jié)核特別是菌陰肺結(jié)核的臨床診療過(guò)程中積極推廣。

綜上所述，采用電子支氣管鏡肺泡沖洗檢查聯(lián)合抗酸染色，聯(lián)合BD-960快速培養(yǎng)、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及羅氏培養(yǎng)檢測(cè)能夠明顯提升菌陰肺結(jié)核患者的陽(yáng)性檢出率，對(duì)提高菌陰肺結(jié)核診斷具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。