張晨曦 佟雪梅

肺癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤，我國肺癌發(fā)病率和病死率均位列惡性腫瘤之首，5年生存率僅為19.7%[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌最常見和最具侵襲性的類型倍受醫(yī)學界關(guān)注，盡管開展了大量的研究，其潛在的分子機制仍未明確?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid，lncRNA)表達和功能異常與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)[3]。分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizes non-protein coding Rnas，DANCR)是一種有價值的腫瘤相關(guān)lncRNA，在肝細胞癌，乳腺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達異常，與癌細胞增殖，遷移和侵襲有關(guān)[4]。但LncRNADANCR在NSCLC的表達特點以及臨床意義尚不清楚，本研究擬探討LncRNADANCR與NSCLC臨床病理信息和預后的關(guān)系。

資料與方法

一、臨床資料

本研究已經(jīng)獲得院倫理委員會批準(批準號：150361)，回顧性選擇2015年12到2017年12月某院收治的173例NSCLC患者，納入標準：①均接受胸腔鏡肺癌根治手術(shù)，術(shù)后組織病理學證實病理類型為NSCLC；②術(shù)前未接受放療、化療、免疫、靶向以及中醫(yī)藥等形式抗腫瘤治療；③具備可供本研究分析的臨床和病理資料。排除標準：①同時經(jīng)臨床確診合并其它部位原發(fā)惡性腫瘤或其它原發(fā)腫瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移者；②經(jīng)臨床確診的血液和免疫系統(tǒng)疾病；③組織標本損壞，無法完成檢測者?；颊哔Y料：男103例，女70例，年齡≥60歲105例，<60歲68例，腫瘤直徑≥3 cm 118例，<3 cm 55例；病理類型：鱗癌72例，腺癌53例，大細胞癌48例；分化程度：低～中度分化133例，高度分化40例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期82例，ⅢA期91例。

二、LncRNADANCR表達檢測

取病理室液氮冷凍保存的NSCLC的癌組織標本以及癌旁經(jīng)病理證實為正常肺組織的標本，Trizol RNA 提取試劑(美國賽默飛公司)提取組織總RNA并進行純化，選取吸光度260/280比值位于1.9～2.1的 RNA，Invitrogen SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(美國賽默飛公司將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，VeritiPro PCR儀(美國賽默飛公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，2-ΔΔCt計算LncRNADANCR相對表達量，取3次測量平均值。引物合成及序列測定由上海基康公司完成，序列：LncRNADANCR，上游，5′-GCCACAGGAGCTAGAGCAGT-3′，下游，5′-GCAGAG TATTCAGGGTAAGGGT-3′，β-actin(內(nèi)參)，上游：5′-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3′，下游：5′-AAGGAA GGCTGGAAGAGT-3′。

三、隨訪

患者出院后由腫瘤科醫(yī)師或護理人員采用電話或微信形式隨訪3年，并定期接受門診復查，復查內(nèi)容包括血常規(guī)和生化，腫瘤標志物以及肺CT/MRI，全身骨掃描等，結(jié)合實驗室和影像檢查結(jié)果，以再次發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤病灶或遠處轉(zhuǎn)移病灶判定為腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移。統(tǒng)計復發(fā)轉(zhuǎn)移以及全因死亡情況。無進展生存(progression-free survival，PFS)定義為自術(shù)后至腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移、全因死亡或隨訪截止時間，總生存(overall survival，OS)時間，定義為自術(shù)后至全因死亡或隨訪截止時間。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、NSCLC癌組織及癌旁組織LncRNADANCR表達比較

NSCLC癌組織與癌旁組織LncRNADANCR相對表達量分別為3.02±0.82、1.15±0.26，配對t檢驗結(jié)果示NSCLC癌組織LncRNADANCR相對表達量明顯高于癌旁組織(t=-27.684，P<0.05)(見圖1)。

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織LncRNADANCR表達

二、NSCLC癌組織LncRNADANCR表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤直徑≥3 cm 、TNM分期ⅢA期、低～中度分化患者LncRNADANCR表達高于腫瘤直徑<3 cm 、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者(P<0.05)，不同性別、年齡分布、病理類型之間LncRNADANCR比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表1)。

表1 不同NSCLC癌臨床病理特征患者LncRNADANCR表達比較

三、不同LncRNADANCR表達下NSCLC患者生存比較

173例患者中失訪21例，余152例患者在隨訪期間死亡84例，復發(fā)10例，遠處轉(zhuǎn)移17例，繪制Kaplan-Meier生存曲線分析，LncRNADANCR高表達(LncRNADANCR≥3.02，42例)3年P(guān)FS生存率為34.18%(27/79，95%CI：0.2465～0.4518)，3年OS生存率為18.99%(15/79，95%CI：0.1174～0.2911)，低于LncRNADANCR低表達(LncRNADANCR<3.02，40例)的56.16%(41/73，95%CI：0.4475～0.6696)、35.62%(26/73，95%CI：0.2558～0.4709)(Log-Rank χ2=8.862、7.287，P=0.003、0.007)(見圖2)。

圖2 不同LncRNADANCR表達下NSCLC患者3年生存曲線

四、影響NSCLC患者預后的單因素Cox比例風險回歸

以NSCLC患者生存情況為因變量(0=存活，1=死亡)，納入年齡(賦值：0=<60歲，1=≥60歲)、腫瘤直徑(賦值：0=<3 cm，1=≥3 cm)、病理類型(賦值：0=鱗癌，1=腺癌，大細胞癌)、分化程度(賦值：0=高度分化，1=低～中度分化)、TNM分期(賦值：0=Ⅰ～Ⅱ期，2=ⅢA期)、LncRNADANCR(賦值：0=LncRNADANCR低表達，1=LncRNADANCR高表達)為自變量。單因素Cox比例風險回歸分析結(jié)果顯示分化程度、TNM分期、LncRNADANCR高表達與NSCLC患者預后有關(guān)(P<0.05)(見表2)。多因素Cox比例風險回歸模型(向后逐步法篩選變量，入α=0.05，出α=0.10)，結(jié)果顯示TNM分期ⅢA期、LncRNADANCR高表達是NSCLC患者不良預后的危險因素(P<0.001)(見表3)。

表2 影響NSCLC患者預后的單因素Cox比例風險回歸模型

表3 影響NSCLC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型

討 論

隨著基因測序、基因芯片、PCR檢測等分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，肺癌發(fā)病機制研究取得了一定的突破和進展。LncRNA是人類和哺乳動物多數(shù)基因組產(chǎn)物的存在形式，并調(diào)節(jié)絕大多數(shù)生理和病理過程，LncRNA作為增強劑、支架或誘餌通過與其他RNA或蛋白質(zhì)相互作用，影響細胞信號級聯(lián)，蛋白質(zhì)或核酸的功能和穩(wěn)定性[5]。LncRNA表達異常，影響蛋白或核酸功能以及穩(wěn)定性，包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和發(fā)展過程[6]?，F(xiàn)有研究顯示，多種LncRNA參與NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲過程[7-8]，與NSCLC對化療的敏感性[9-10]有關(guān)。

LncRNADANCR是一種具有致癌作用的LncRNA，定位于人類染色體4q12，具有直接調(diào)控癌基因作用，還可通過扮演競爭性內(nèi)源RNA間接調(diào)控miRNA 對靶基因的調(diào)節(jié)作用[11]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)LncRNADANCR在卵巢癌中表達，通過靶向miR-145調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子表達，促使腫瘤新生血管形成[12]，在三陰性乳腺癌中，LncRNADANCR通過激活核受體視黃酸X受體α增強其絲氨酸磷酸化，啟動磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)錄，導致腫瘤發(fā)生[13]。LncRNADANCR高表達與骨肉瘤組織分型、TNM分期呈正相關(guān)，LncRNADANCR通過靶向miR-149/ Musashi 2(無中文名稱)軸調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNADANCR在NSCLC中呈高表達，且腫瘤直徑≥3 cm 、TNM分期ⅢA期、低～中度分化患者LncRNADANCR表達高于腫瘤直徑<3 cm 、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者，說明LncRNADANCR高表達與NSCLC腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期有關(guān)。Chen等人[15]報道顯示肺癌中LncRNADANCR表達上調(diào)，抑制LncRNADANCR表達則癌細胞增殖力減弱，凋亡增加，說明LncRNADANCR在NSCLC發(fā)病機制中可能發(fā)揮促癌基因作用。LncRNADANCR可能通過調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導途徑參與NSCLC發(fā)病和進展， LncRNADANCR可靶向miR-214-5p，啟動其下游基因鋅指蛋白1，調(diào)控肺癌細胞增殖和凋亡[15]。LncRNADANCR也可通過與高遷移率族盒蛋白4競爭性結(jié)合miR-138影響Sox4的表達參與NSCLC發(fā)病進展[16]。LncRNADANCR還可作用于Wnt/β-鏈蛋白信號通路[17]、miR-1225-3p/ erb-b2受體酪氨酸激酶2信號通路[18]、叉頭框蛋白O1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路[19]促進NSCLC細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。也有學者認為LncRNADANCR可調(diào)節(jié)核因子κB 炎癥信號通路介導 NSCLC 腫瘤炎癥微環(huán)境，促使癌細胞增殖和遷移[20]。本研究進一步通過隨訪發(fā)現(xiàn)LncRNADANCR與NSCLC患者預后有關(guān)，LncRNADANCR高表達者PFS和OS生存率偏低，回歸分析證實LncRNADANCR高表達與術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移和患者死亡有關(guān)，提示LncRNADANCR可作為NSCLC預后判斷的生物學指標。

綜上，NSCLC 癌組織中LncRNADANCR表達上調(diào)，LncRNADANCR高表達與NSCLC較大的腫瘤直徑、較高的TNM分期和低存活率有關(guān)。LncRNADANCR有望作為NSCLC預后判斷的潛在標志物，為NSCLC提供新的治療靶點和方向。LncRNADANCR與病理類型無關(guān)，與腫瘤分化程度、大小有關(guān)。