李夢詩，張金秀，覃蒙斌，廖存，孫娟，吳晴茹，黃杰安△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西南寧 530007

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

國際癌癥研究中心2020年的研究數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌是全球第三大癌癥，其死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的9.4%，成為癌癥死亡的第二大原因[1]。由于大部分患者確診時已為癌癥晚期，因此結(jié)直腸癌患者5年生存率較低[2]。血管生成是導(dǎo)致結(jié)直腸癌高死亡率和不良預(yù)后的主要原因之一，而血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是刺激腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子[3-4]。VEGF促進血管生成的過程涉及許多蛋白和信號通路，如PI3K-AKT和MAPK信號通路等[5-6]。目前靶向VEGF的抗血管生成治療可使更多的結(jié)直腸癌患者獲益，但仍然有一部分患者對藥物產(chǎn)生耐藥性[7]，因此血管生成的其他可能機制仍需進一步探索。三細胞緊密連接蛋白（tricellulin）作為緊密連接相關(guān)MARVEL蛋白家族中的一員，主要分布在三個細胞連接處[8]，在調(diào)控細胞膜的通透性以及大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明tricellulin的異常表達與扁桃體鱗狀細胞癌[10]、肝癌[11]、膽管癌[12]、胰腺癌[13]等的進展及預(yù)后密切相關(guān)。李思漫等[14]研究表明，tricellulin在結(jié)直腸癌中高表達，提示tricellulin與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。緊密連接蛋白家族中的其他成員如ZO-1、occludin和claudin-5等與血管生成密切相關(guān)[15-16]，但tricellulin與結(jié)直腸癌血管生成的關(guān)系尚不清楚。本研究通過分析人結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF的表達情況及其與微血管密度（microvascular density，MVD）的相關(guān)性，探索tricellulin在結(jié)直腸癌中表達的臨床意義及其與血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年3月至2013年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科收治的21例結(jié)直腸癌患者為研究對象，收集外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織（距離癌組織大于10 cm）標本各21例?；颊吣挲g25～76歲，平均（56.0±14.0）歲；男性12例，女性9例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ+Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例；有遠處轉(zhuǎn)移者10例。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）年齡＞18歲，性別不限；（2）經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌。排除標準：（1）術(shù)前接受抗腫瘤治療（放療、化療、免疫治療或靶向治療）；（2）患者臨床病理資料不完整；（3）合并有其他惡性腫瘤；（4）伴有其他腸道器質(zhì)性疾病。

1.3 免疫組化實驗

組織標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度約為4 μm），并將切片貼附于載玻片上。將制好的玻片置于65℃恒溫烘箱中烘烤2 h，再浸泡于二甲苯中脫蠟，然后依次置于100%、95%、85%、75%梯度乙醇中水化，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)10 min，接著用3% H2O2室溫孵育15 min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min。滴加山羊血清室溫封閉15 min后，加入一抗（tricellulin濃度為1:100，VEGF濃度為1:100，CD34濃度為1:200）4℃恒溫孵育過夜。陰性對照組用PBS代替一抗。第二天室溫復(fù)溫1 h，用PBS洗滌3次后加入二抗于37℃恒溫孵育15 min。然后，用PBS洗滌3次后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素孵育15 min，洗滌3次后加入DAB顯色2 min，清水沖洗干凈后再用蘇木精復(fù)染細胞核5 min，最后，中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察細胞染色情況，并進行MVD計數(shù)。實驗使用的主要試劑有：tricellulin多克隆抗體（Sigma-Aldrich，美囯），VEGF多克隆抗體（Proteintech Group，美國），CD34抗體（北京傲銳東源生物公司，中國），免疫組化SP試劑（北京中杉金橋公司，中國），DAB顯色試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液和蘇木精（北京索萊寶生物公司，中國）。

1.4 觀察指標

（1）tricellulin以細胞膜、細胞質(zhì)或細胞核染色呈棕黃色為陽性細胞，VEGF以細胞質(zhì)染色呈黃色或棕色為陽性細胞。采用半定量法結(jié)合細胞染色強度和陽性細胞數(shù)比例判定表達結(jié)果[17]。根據(jù)細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細胞百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將上述兩項得分結(jié)果相乘：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++），以（-）和（+）定義為陰性表達，以（++）和（+++）定義為陽性表達。（2）MVD計數(shù)采用Weidner法[18]，計數(shù)標準：任何可被CD34染成棕黃色的血管內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，與鄰近血管、腫瘤細胞或其他組織之間存在明顯分隔的視為1個微血管。于顯微鏡低倍鏡下（×100）在找到微血管密集區(qū)域，然后在高倍鏡下（×400）計數(shù)5個視野的微血管數(shù)，取平均值。所有切片均采用雙盲法閱片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料用[n(%)]或（n）表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。等級資料采用Spearman秩相關(guān)進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中tricellulin、VEGF表達情況及MVD比較

Tricellulin主要在細胞核和細胞質(zhì)中表達，細胞膜上有少量表達，VEGF在細胞質(zhì)中表達，CD34在內(nèi)皮細胞中表達，且這三者在結(jié)直腸癌組織中的表達高于癌旁正常組織。見圖1。

圖1 免疫組化實驗結(jié)果圖

結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF陽性表達比例均高于癌旁正常組織，MVD大于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中tricellulin、VEGF表達情況及MVD比較

2.2 結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF表達情況的相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF的表達呈正相關(guān)（r=0.79，P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF表達情況的相關(guān)性分析

2.3 結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF的表達情況與MVD的關(guān)系

Tricellulin陽性表達、VEGF陽性表達的結(jié)直腸癌組織中的MVD分別大于tricellulin陰性表達、VEGF陰性表達的結(jié)直腸癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)直腸癌組織中tricellulin和VEGF的表達情況與MVD的關(guān)系

2.4 Tricellulin、VEGF的表達情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

Tricellulin、VEGF的表達與患者年齡、性別無關(guān)（均P＞0.05）；tricellulin、VEGF的表達與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。見表4。

表4 Tricellulin、VEGF的表達情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系n

表4（續(xù)）

2.5 不同結(jié)直腸癌臨床病理特征的MVD比較

不同性別、年齡的結(jié)直腸癌患者的MVD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的MVD大于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的MVD大于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同結(jié)直腸癌臨床病理特征的MVD比較

3 討論

Tricellulin是首個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接跨膜蛋白，主要分布在三個相鄰細胞連接處[8]。既往研究顯示，tricellulin在扁桃體鱗狀細胞癌[10]和肝癌[11]中低表達；此外tricellulin的表達還與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，在低分化的胰腺導(dǎo)管癌中tricellulin表達更低[13]。這些研究表明，tricellulin的低表達與腫瘤進展相關(guān)，可能是由于tricellulin的減少導(dǎo)致細胞間的連接不夠緊密，破壞細胞屏障，影響細胞極性和細胞粘附，從而影響腫瘤進展。此外，Takasawa等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在低分化的胰腺癌組織中，tricellulin主要分布在胰腺癌細胞的細胞核中，且tricellulin的核定位能夠促進細胞增殖和侵襲。Kyuno等[20]的體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，tricellulin主要分布在低分化的胰腺癌細胞PANC-1的細胞核內(nèi)，促進胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Masuda等[21]的研究顯示，tricellulin分布在胃正常組織的三細胞緊密連接處，而在胃癌組織中，tricellulin則分布于細胞質(zhì)中。本研究結(jié)果顯示，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中表達較癌旁正常組織高，且主要在細胞質(zhì)和細胞核中表達，這與Takasawa、Kyuno和Masuda等的研究結(jié)果相一致。

血管生成是腫瘤細胞的生存機制之一，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移在很大程度上依賴于血管生成[22]。血管生成的特征主要是活化的血管擴張，血管通透性增加，周圍基質(zhì)降解，從而促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移[22-24]。有研究表明，細胞缺氧會誘導(dǎo)一氧化氮、VEGF和血管緊張素等血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，血管活性物質(zhì)與細胞外基質(zhì)蛋白酶相互作用增加毛細血管壁的通透性，引起內(nèi)皮細胞增殖、遷移，從而促進血管生成以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23-24]。VEGF表達于人體各類細胞中，在促進血管內(nèi)皮細胞生長、誘導(dǎo)新生血管的形成方面起著重要作用[25]。Simonetti等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在腫瘤組織中過表達可促進腫瘤微血管的形成，并在腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。MVD作為評估腫瘤血管形成的良好指標，一定程度上反映腫瘤血供豐富程度，腫瘤組織中MVD越豐富，腫瘤生長越快，間接預(yù)示患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中tricellulin的表達與VEGF呈正相關(guān)，且tricellulin和VEGF陽性表達的結(jié)直腸癌組織中的MVD大于tricellulin和VEGF陰性表達的結(jié)直腸癌組織，提示結(jié)直腸癌中tricellulin的表達與血管生成相關(guān)。Erickson等[27]的研究表明，視網(wǎng)膜中VEGF的改變會影響緊密連接蛋白相關(guān)蛋白occludin磷酸化水平以及血管的通透性，具體的作用機制尚不清楚，但緊密連接蛋白很有可能通過激活或抑制相關(guān)信號通路改變血管通透性，從而影響血管生成。而tricellulin作為緊密連接蛋白的家族成員之一，其與血管生成的關(guān)系尚不明確，也鮮少有關(guān)于tricellulin與腫瘤血管生成的研究報道。Shimada等[28]的研究發(fā)現(xiàn)敲除脂解刺激蛋白受體（LSR）可誘導(dǎo)tricellulin從三細胞緊密連接處移位至雙細胞緊密連接處，從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移和侵襲。Cording等[29]的研究發(fā)現(xiàn)在缺血或缺氧條件下，tricellulin也可發(fā)生由三細胞間向雙細胞間的重分布。我們推測tricellulin分布的改變可能與血管代償性生成有關(guān)，以滿足腫瘤生長所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。

在不同腫瘤中，tricellulin與疾病預(yù)后的關(guān)系也不完全一致。Schlachter等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin過表達的肝母細胞瘤患者的預(yù)后較好。tricellulin低表達與膽管癌不良預(yù)后相關(guān)，而肝細胞癌的不良預(yù)后卻與tricellulin過表達相關(guān)[12]。此外，tricellulin過表達與胰腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較短的生存期有關(guān)[19]。本研究結(jié)果與上述研究一致，我們發(fā)現(xiàn)tricellulin表達與患者年齡、性別無關(guān)，而與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。此外，研究表明MVD與結(jié)直腸癌患者的無復(fù)發(fā)生存時間（RFS）和總生存期（OS）呈負相關(guān)，VEGF高表達預(yù)示著較差的RFS[31]。Carvalho等[32]發(fā)現(xiàn)，MVD越大，乳腺癌患者遠處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險就越高。隨著MVD數(shù)量的增加，腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性增加[33-34]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的VEGF陽性表達比例分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的MVD分別大于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者。

綜上所述，tricellulin可能參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌血管生成，影響腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展。然而，本研究僅局限于臨床樣本的檢測，未來還需要開展細胞分子實驗、動物實驗以探究tricellulin參與調(diào)節(jié)血管生成及其影響腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展的相關(guān)分子機制。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。