胡英華，賈炳超，尚 鑫，于立清，孫 波*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春健康職業(yè)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

朱砂的毒性主要源于包括汞在內(nèi)的某些成分在腎臟的蓄積而引起的腎臟功能減退，乃至衰竭[1-2]。由于這種蓄積隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，所以，朱砂腎毒性機(jī)理的研究對(duì)于老年人尤為重要。由于細(xì)胞凋亡的進(jìn)程受到多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控[3]，但前期研究結(jié)果排除了朱砂腎毒性對(duì)JNK通路、Caspase-9介導(dǎo)的線粒體信號(hào)通路等的影響，同時(shí)考慮到重金屬汞離子可以與谷胱甘肽的巰基結(jié)合而影響谷胱甘肽在血液中或臟器中的水平，因此本實(shí)驗(yàn)將朱砂的腎毒性鎖定在與谷胱甘肽水平相關(guān)的氧化應(yīng)激通路[4-5]。

前期的MTT實(shí)驗(yàn)與HE實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果已經(jīng)證明，朱砂以及Hg2+和HgS，經(jīng)連續(xù)給藥后均會(huì)在不同程度上導(dǎo)致腎臟的病變，并且病變程度與劑量呈同向變化規(guī)律，所以，本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，將這些物質(zhì)對(duì)血液與腎臟中的谷胱甘肽及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的影響作為指標(biāo)，進(jìn)一步研究朱砂的腎毒性機(jī)理。

研究表明，針灸某些穴位可以提高肝臟組織中的谷胱甘肽水平及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性[6-8]，考慮到腎臟與肝臟之間存在精與血之間相互滋生和相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了針灸對(duì)照組，以此來(lái)研究針灸對(duì)氧化應(yīng)激的緩解作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Sigma臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；組織勻漿機(jī)江蘇金壇江南儀器廠；Mettler Toledo AL204電子分析天平（萬(wàn)分之一）Agilent 1260高效液相色譜儀美國(guó)安捷倫通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平（十萬(wàn)分之一）梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TD4臺(tái)式低速離心機(jī)；南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司（4 000 r/min）；ODS高效液相色譜柱大連依利特分析儀器有限公司；Sigma臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司3K15；FA1004B型電子天平上海佑科儀器儀表有限公司；19686酶標(biāo)儀美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥劑

水飛朱砂（批號(hào)：20141213）安國(guó)市藥材天然粉貿(mào)易有限公司；硫化汞（分析純）（批號(hào)：20160503）北京化工廠；檸檬酸鈉（分析純）（批號(hào)：20160708）北京化工廠；乙腈（色譜純）（批號(hào)：20160205）Fisher實(shí)驗(yàn)器材有限公司；氫氧化鈉（分析純）（批號(hào)：20150107）北京化工廠；高氯酸（分析純）（批號(hào)：20161126）天津市鑫源化工有限公司；甲醇（色譜純）（批號(hào)：20151117143）山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；磷酸氫二鉀（分析純）（批號(hào)：201504021）西隴化工股份有限公司；氯化鈉（分析純）（批號(hào)：20160105）北京化工廠；EDTA（分析純）（批號(hào)：20160105）天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；硝酸（優(yōu)級(jí)純）（批號(hào)：20150508) 北京化工廠；DTNB標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：D218200）SIGMA-ALDRICH公司；谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：G4251）SIGMA-ALDRICH公司；GSH-P測(cè)試盒（批號(hào)：20180116）；南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

將飼養(yǎng)1周的80只CL級(jí)SD大鼠（雌雄各半）按照性別隨機(jī)平均分為10組，每組為8只。第1組為雄性空白對(duì)照組，第2組為雌性空白對(duì)照組，第3組為雄性朱砂（飽和溶液）實(shí)驗(yàn)組，第4組為雌性朱砂實(shí)驗(yàn)組，第5組為雄性HgS（飽和溶液）實(shí)驗(yàn)組，第6組為雌性HgS實(shí)驗(yàn)組，第7組為雄性HgCl2實(shí)驗(yàn)組，第 8 組為雌性 HgCl2（30 μg·mL-1）實(shí)驗(yàn)組，第9組為雄性HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組，第10組為雌性HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組。各組實(shí)驗(yàn)大鼠每天稱重1次，并按其實(shí)際體質(zhì)量給藥（0.01 mL·g-1），每天給藥2次，早上9點(diǎn)開(kāi)始，晚上18點(diǎn)開(kāi)始，第9、10組每天中午12點(diǎn)針灸腎俞和足三里1次。于第16天早上，先經(jīng)眼眶取血，隨后立即頸椎脫臼處死，并迅速取出腎臟稱重，備用。

2.1 腎臟組織及血液中谷胱甘肽水平變化的實(shí)驗(yàn)研究

2.1.1 腎臟組織中谷胱甘肽水平變化的實(shí)驗(yàn)研究 取1/2腎臟，按5:1（V:W）比例將冷藏的A液加入腎臟中，用組織勻漿機(jī)制成勻漿，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，用Sigma臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)在-4 ℃下、以14 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min。取上清液適量，按1:3（V:V）比例加入冷藏的B液，渦旋振蕩3 min，然后加入0.5 mL DTNB，渦旋振蕩10 min，于4 000 r·min-1離心10 min，定量取上清液 500 μL，按 10:1（V:V）加入 2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用針式濾器過(guò)濾后取10 μL于高效液相色譜儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 各腎臟谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

表1 各腎臟谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組別 雌性谷胱甘肽含量雄性谷胱甘肽含量 平均值朱砂組 116.47±1.10# 120.37±1.14## 118.42±2.28#HgS 組 144.76±1.31## 129.42±2.15## 137.09±8.11##HgCl2組 216.09±0.92## 194.55±0.79## 205.32±11.16##HgCl2+針灸組 217.01±1.45## 195.98±1.10## 206.49±10.93##空白組 114.86±1.42 113.99±1.56 114.43±1.51

圖1 各組腎臟中谷胱甘肽含量

由表1和圖1可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無(wú)論對(duì)于雄性大鼠，還是雌性大鼠而言，各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量相對(duì)于空白對(duì)照組來(lái)講，均有所升高，而且這種變化具有顯著性差異（#P＜0.05，##P＜0.01）。其中，HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量的升高最顯著，HgCl2實(shí)驗(yàn)組、HgS實(shí)驗(yàn)組、朱砂實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量的升高幅度依次減小。

2.1.2 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取5 mg的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用pH=7.50的PBS定容，制成濃度為200 ug·mL-1的母液。分別吸取0.2 mL、0.8 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL至10 mL的容量瓶中，用pH=7.50的PBS定容，分別取不同濃度的谷胱甘肽溶液500 μgL，按1:1（V:V）加入DTNB溶液，靜置10 min，用針式濾器過(guò)濾后取10 μL于高效液相色譜儀檢測(cè)其含量，經(jīng)線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=20.149 45X+ 0.555 25（R2=0.999 99）其中：Y為吸光度，X為濃度。

2.1.3 谷胱甘肽高效液相色譜條件 以0.9%甲酸水溶液（用NaOH調(diào)pH=5.20）與6%四氫呋喃乙腈溶液為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，進(jìn)樣后按照表2進(jìn)行梯度洗脫。

表2 谷胱甘肽高效液相色譜條件梯度洗脫時(shí)間表

2.1.4 特殊試劑配制 1）A液的配制：取21 mL高氯酸，用去離子水定容100 mL。2）B液的配制：精密稱定6.846 6 g磷酸氫二鉀、0.074 5 g乙二胺四乙酸二鈉、0.588 2 g檸檬酸鈉，加去離子水溶解，配制成100 mL溶液。3）DTNB的配制：精密稱定8.953 5 g十水合磷酸氫二鈉，制成250 mL去離子水溶液，并用檸檬酸調(diào)PH至7.50，備用。精密稱定0.198 2 g的DTNB，加入適量上述磷酸鹽溶液制成100 mL溶液。

2.1.5 血液樣品的制備及谷胱甘肽含量的測(cè)定 將經(jīng)眼眶取出的800 μL血置于2 mL EP管中，按1:1（V:V）加入800 μL的DTNB溶液，離心（4 000 r·min-1）10 min，取上清液適量并按10:1（V:V）比例加入冷藏的A液，渦旋振蕩5 min，于4 000 r·min-1再離心10 min，取10 μL上清液于高效液相色譜儀測(cè)其谷胱甘肽含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組血液中谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

表3 各組血液中谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

組別 雌性谷胱甘肽含量雄性谷胱甘肽含量 平均值朱砂組 5.78±0.75 5.93±0.59 5.86±0.65 HgS 組 5.59±0.85 6.01±0.74 5.80±1.19 HgCl2組 5.90±0.52 5.82±1.03 5.86±1.80 HgCl2+ 針灸組 5.82±0.72 5.97±0.97 5.80±0.75空白組 5.34±1.46 5.75±1.87 5.55±1.48

圖2 各組血液中谷胱甘肽含量

由表3和圖2可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無(wú)論是雄性大鼠，還是雌性大鼠，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血液中的谷胱甘肽水平相對(duì)于空白對(duì)照組來(lái)講均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

2.2 腎臟組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力的實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 腎臟樣品的制備及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力的測(cè)定 將2.1.1余下的1/2腎臟稱重，并按1:8（W:V）比例加入冷藏的生理鹽水，用組織勻漿機(jī)制成勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，于-4℃、3 000 r·min-1的條件下離心15 min，取出上清溶液，備用。

取5 μL，加入酸性染色液5 mL，靜置10 min后，用酶標(biāo)儀于595 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并據(jù)此分析樣品中總蛋白的含量。

另取上清液0.1 mL，按下表加入試劑盒中的試劑1與試劑2。

?

混勻，-4℃、4 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL，并按下表加入試劑盒中的試劑3～5作顯色反應(yīng)。

?

混勻，室溫靜置15 min，待顯色反應(yīng)達(dá)成平衡后，用酶標(biāo)儀于412 nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度，并據(jù)此分析谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力，結(jié)果見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組腎臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力（±s，n=8）

表4 各組腎臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力（±s，n=8）

注：與空白組比較，## P＜0.01

組別 雌性GSH過(guò)氧化物酶酶活力雄性GSH過(guò)氧化物酶酶活力 平均值朱砂組 36.53±0.67## 36.40±1.12## 36.46±0.89##HgS 組 36.10±0.98## 36.99±1.16## 36.55±1.14##HgCl2組 34.84±0.71## 34.46±0.67## 34.65±0.69##HgCl2+針灸組 37.72±0.16## 38.24±028## 37.98±0.34##空白組 38.24±0.73 39.93±0.91 39.09±1.18

圖3 各組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力測(cè)定數(shù)據(jù)

由表4和圖3可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無(wú)論對(duì)于雄性大鼠，還是雌性大鼠而言，各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽過(guò)氧化酶活力均有明顯降低，而且這種變化還具有顯著性差異（##P＜0.01）。其中，HgCl2實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽過(guò)氧化酶活力的降低最顯著，HgS實(shí)驗(yàn)組、朱砂實(shí)驗(yàn)組、HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組谷胱甘肽過(guò)氧化酶活力下降值依次減小。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制備 精密稱定牛血清白蛋白2 mg，加去離子水制成0.2 mg·mL-1的母液。再精密量取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL，分別置于5 mL的EP管中，加去離子水至總體積為1 mL，分別再加入G-250試劑（酸性染色液）5 mL，立即混勻，靜置10 min后以1號(hào)的EP管為空白對(duì)照，在595 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以X表示總蛋白含量為橫坐標(biāo)，Y表示吸光度值，得線性回歸方程：Y=0.002 5X+ 0.208（R2=0.997 6）

3 討論

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的對(duì)朱砂毒性研究，幾乎所有的參與者都達(dá)成了這樣的共識(shí)，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的供試品中，可溶于水的Hg2+含量越高，經(jīng)連續(xù)給藥后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟組織中Hg2+的含量就會(huì)越高。這一結(jié)論可以從生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)理論中找到依據(jù)，因?yàn)橹焐爸械闹饕拘猿煞止且钥扇苡谒腍g2+形式、按照微孔途徑的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理透過(guò)胃腸道生物膜而被吸收進(jìn)入血液，并以同樣的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理分布于包括腎臟在內(nèi)的機(jī)體相關(guān)組織中，所以，供試品中Hg2+的濃度與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟組織中Hg2+的含量成正比。然而，與這一結(jié)果相符的應(yīng)該是“腎臟組織中Hg2+的含量越高，谷胱甘肽的水平就應(yīng)該越低”，因?yàn)楣入赘孰目梢耘c包括Hg2+在內(nèi)的重金屬離子形成配合物而排出體外。但是，這一推測(cè)顯然不符合表1和圖1中的數(shù)據(jù)顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

成熟的理論表明，谷胱甘肽以還原型（GSH）及其氧化型（GSSG）兩種形式廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，并以GSH/GSSG比例遠(yuǎn)超過(guò)10:1來(lái)維持生物或植物的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡，以此將活性氧（ROS）控制在較低的水平，使之精密地調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、癌變及基因的表達(dá)。當(dāng)GSH/GSSG比例明顯減小時(shí)，活性氧（ROS）的水平就會(huì)升高，其調(diào)節(jié)功能亦隨之而降低，從而使細(xì)胞受到損傷。由此可以推測(cè)，腎毒性最強(qiáng)的HgCl2組腎臟組織中的谷胱甘肽水平應(yīng)該最低。這樣推測(cè)的結(jié)果顯然也與表1和圖1中數(shù)據(jù)顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符。

表4 和圖3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GPX4）活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出了上述兩個(gè)問(wèn)題的答案。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性是谷胱甘肽還原體內(nèi)脂質(zhì)氧化物的重要標(biāo)志，其活性高，表明有足夠量的還原型谷胱甘肽參與機(jī)體的正常生理活動(dòng)；而其活性低則表明谷胱甘肽沒(méi)有作為還原劑起到還原作用，GSH/GSSG比例明顯下降，使得GSH沒(méi)有作為還原劑來(lái)維持氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡。在一般的生理環(huán)境下，還原型谷胱甘肽所占的比例減小的原因無(wú)非就是形成了氧化型谷胱甘肽。然而，在Hg2+存在的條件下，還原型谷胱甘肽還可以其巰基上的孤對(duì)電子向Hg2+的空d軌道配位，形成了比較穩(wěn)定的配合物。而這種配合物的形成無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致游離型谷胱甘肽的減少，進(jìn)而造成腎臟的氧化應(yīng)激性損傷。

按照一般規(guī)律，重金屬離子與谷胱甘肽結(jié)合后便會(huì)排出體外，也正因?yàn)槿绱?，各?shí)驗(yàn)組大鼠血液中的谷胱甘肽水平均應(yīng)該低于對(duì)照組。然而，生成于腎細(xì)胞內(nèi)部的這種配合物卻很難以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式排出體外，所以才導(dǎo)致了與谷胱甘肽生成配合物的Hg2+在腎臟的蓄積。由于這種蓄積影響了細(xì)胞的正常的內(nèi)部環(huán)境，因而也是導(dǎo)致腎細(xì)胞死亡的重要因素之一。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雖然HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟的谷胱甘肽水平基本同于HgCl2實(shí)驗(yàn)組，但是HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟的谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性卻僅低于對(duì)照組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟的谷胱甘肽總量與HgCl2實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟的谷胱甘肽總量相近，但HgCl2+針灸實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟游離的谷胱甘肽所占的比例較高。由此可見(jiàn)，針灸刺激某些特殊穴位，如腎俞和足三里，可以提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力，增強(qiáng)活性氧對(duì)谷胱甘肽的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)減少谷胱甘肽與Hg2+形成配合物的比例，這無(wú)疑會(huì)在一定程度上促進(jìn)谷胱甘肽作為還原劑參與腎臟細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)朱砂以及Hg2+造成的氧化應(yīng)激起到一定的緩解作用。這一研究結(jié)果為臨床上采用針灸方法對(duì)抗連續(xù)使用含有朱砂的制劑引起的腎臟損傷提供了依據(jù)。