陸潔淼，張家豪，明乾良，王 潔，周桂芬，朱 波*，秦路平*

西紅花球莖腐爛病拮抗真菌的篩選、鑒定及抑菌機(jī)制

陸潔淼1，張家豪1，明乾良2，王 潔1，周桂芬1，朱 波1*，秦路平1*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系，重慶 400038

篩選西紅花球莖腐爛病拮抗真菌，探討其抑菌機(jī)制。以前期分離得到的24株西紅花內(nèi)生真菌為材料，采用平板對(duì)峙法篩選球莖腐爛病拮抗真菌；應(yīng)用ITS分子技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，用掃描電鏡觀察拮抗后病原菌尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)；檢測(cè)拮抗菌株CS05菌絲產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶的含量及病原菌產(chǎn)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的含量。篩選得到對(duì)尖孢鐮刀菌有顯著拮抗作用的內(nèi)生真菌8株，其中CS05抑制效果最好，相對(duì)抑制率為（76.53±3.82）%；將CS05鑒定為擔(dān)子菌門(mén)多孔菌目栓菌屬真菌變色栓菌；CS05能產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶，促使尖孢鐮刀菌胞外AKP含量增加，菌絲出現(xiàn)稀疏紊亂、纏繞皺縮等現(xiàn)象。西紅花內(nèi)生真菌CS05能較好地拮抗球莖腐爛病菌尖孢鐮刀菌，為西紅花球莖腐爛病的生物防治提供了參考依據(jù)。

西紅花；球莖腐爛?。粌?nèi)生真菌；拮抗活性；抑菌；β-1,3-葡聚糖酶

西紅花L.是鳶尾科番紅花屬多年生植物，是世界名貴珍稀中藥材，全株僅雌蕊的三分叉紅色絲狀柱頭入藥，產(chǎn)量低而價(jià)值高，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，主治經(jīng)閉癥痕、產(chǎn)后瘀阻、溫毒發(fā)斑、憂郁痞悶、驚悸發(fā)狂[1]。西紅花病害主要有球莖腐爛病與病毒病2類(lèi)，由尖孢鐮刀菌引起的球莖腐爛病是目前已知的最具破壞性的西紅花病害[2]。以浙江省為例，每年有30%～50%的西紅花種植面積遭受病害[3]。目前對(duì)于該病害的防治在實(shí)際生產(chǎn)中依然多用化學(xué)藥液（主要為多菌靈等）噴灌或溴甲烷熏蒸土壤[4]，以減輕病情的發(fā)展。然而長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)對(duì)環(huán)境及生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[5]，并影響與植物相關(guān)的有益微生物區(qū)系，同時(shí)存在病原菌耐藥性的問(wèn)題[6]。生物防治是植物病害防治的重要措施，植物內(nèi)生菌能提高宿主抗病性已被多次報(bào)道[7-9]。目前對(duì)內(nèi)生真菌防治尖孢鐮刀菌的研究主要集中在農(nóng)作物上，如防治黃瓜黃萎病、番茄枯萎病和西瓜枯萎病等[10-13]，關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌提高宿主抗病性的研究鮮有報(bào)道。

研究表明，真菌主要通過(guò)分泌病程相關(guān)蛋白（如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等）、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式，抑制病原菌生長(zhǎng)[14-15]。趙沛等[16]發(fā)現(xiàn)棉花內(nèi)生真菌腐皮鐮刀菌CEF-373可以上調(diào)棉花幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)，從而破壞病原真菌大麗輪枝菌的細(xì)胞壁，抑制病原菌生長(zhǎng)。本研究在前期建立的西紅花內(nèi)生真菌資源庫(kù)的基礎(chǔ)上，篩選能拮抗球莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌的內(nèi)生真菌，并探討其抑菌機(jī)制，為西紅花內(nèi)生真菌資源開(kāi)發(fā)及球莖腐爛病生物防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試菌株

24株西紅花內(nèi)生真菌及病原菌尖孢鐮刀菌由本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存。高山被孢霉（CGMCC，編號(hào)3.12824）和哈茨木霉（CGMCC，編號(hào)3.15684）購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

2×Taq Mix（＋Dye），莫納生物科技有限公司；DL 1000 DNA Marker，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；AKP試劑盒，南京建成生物工程研究所；SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；UV-3600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；LMI-100型霉菌培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；MC-100B型立式恒溫?fù)u床（上海牟測(cè)儀器科技有限公司）；GenoSens 1850型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；Applied Biosystems Veriti 96 Well PCR Thermal Cycler型（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5427R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。Thermo Fisher Multiskan FC 1510型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌抑菌活性篩選

用平板對(duì)峙法測(cè)定供試菌株對(duì)病原菌的抑菌活性，共設(shè)24個(gè)內(nèi)生真菌處理組，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組（高山被孢霉處理組、哈茨木霉處理組），病原菌空白對(duì)照組，計(jì)算相對(duì)抑制率，實(shí)驗(yàn)平行3次。

相對(duì)抑制率＝(對(duì)照病原菌菌落直徑－對(duì)峙病原菌菌落直徑)/對(duì)照病原菌菌落直徑[16]

2.2 內(nèi)生真菌ITS分子鑒定

無(wú)菌條件下挑取少許CS05菌絲置于PDA培養(yǎng)基中活化。28 ℃避光培養(yǎng)7 d，根據(jù)徐麗莉[17]研究的方法提取基因組DNA。供試真菌的ITS和5.8S基因采用通用引物ITS4（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）及ITS5（5’-GGAAGTAA- AAGTCGTAACAAGG-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，稀釋10倍后的引物各1 μL，2×Taq Master Mix（Takara Bio）25 μL，ddH2O 2 μL，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，然后用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列相似性分析，鄰接樹(shù)（neighbor-joining）方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 掃描電鏡觀察

參考侯媛媛[18]的方法進(jìn)行掃描電鏡樣品處理，經(jīng)過(guò)固定、脫水、干燥和噴金后在掃描電鏡下觀察對(duì)照組病原菌與處理組病原菌的菌絲形態(tài)。

2.4 活性酶含量測(cè)定

無(wú)菌條件下挑取少許CS05菌絲置于PDA培養(yǎng)基中活化。28 ℃避光培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，分別按照β-1,3-GA活性測(cè)定試劑盒與幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定試劑盒中提供的方法，采用分光光度計(jì)測(cè)定酶活性，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。β-1,3-GA以每毫克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmol-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活性單位，幾丁質(zhì)酶以每毫克組織每小時(shí)產(chǎn)生1 mg還原糖定義為1個(gè)酶活單位。

對(duì)CS05進(jìn)行發(fā)酵，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min），收集上清液，用0.22 μm孔徑的無(wú)菌濾器濾過(guò)除菌制成無(wú)菌發(fā)酵液，4 ℃保存待用[19-21]。

采用微量法測(cè)病原菌胞外AKP含量，設(shè)CS05無(wú)菌發(fā)酵液處理組，以哈茨木霉為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌PDB為對(duì)照組。對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾，取得新鮮菌絲用無(wú)菌水反復(fù)沖洗后，每稱取菌絲鮮質(zhì)量2 g分裝在一個(gè)離心管內(nèi)。向離心管中分別加入30 mL真菌無(wú)菌發(fā)酵液和無(wú)菌PDB，混勻后置于28 ℃，180 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、9、12 h定時(shí)取混合液5 mL，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min），收集上清液，按照AKP試劑盒中提供的方法，采用酶標(biāo)儀對(duì)AKP含量進(jìn)行測(cè)定，以100 mL液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位（1金氏單位＝7.14 U/L），實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)[22]。

2.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS 25.0軟件對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan多重極差檢驗(yàn)（DMRT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，＜0.05被認(rèn)為存在顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生真菌對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用

平板對(duì)峙結(jié)果顯示，從24株供試菌株中篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌有顯著拮抗作用的內(nèi)生真菌8株，占比33.33%；其中CS05對(duì)病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，相對(duì)抑制率為（76.53±3.82）%，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照高山被孢霉（53.06±5.20）%和哈茨木霉（57.75±3.45）%（＜0.05）（圖1）。

3.2 CS05菌種鑒定

CS05的ITS序列經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，電泳圖見(jiàn)圖2-A。以CS05的ITS和5.8S基因?yàn)榘行蛄?，用Blast程序在GenBank中進(jìn)行DNA序列相似性搜索。結(jié)果表明，CS05與變色栓菌有較高序列相似性。下載比對(duì)網(wǎng)頁(yè)中相似性最高的3個(gè)參考菌株序列，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用于系統(tǒng)發(fā)育分析，以Agaricales （Basidiomycota）的（MN557371）作為外群。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示CS05與（MW742535）、（MW742533）、（KY950437）聚在一起，其序列相似性均為99.33%，形成支持強(qiáng)度為100%的末端分支。

CS05菌落在PDA平板上呈白色，圓形，凸起，干燥，可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)菌絲，中間緊密，邊緣稀薄，隱約可見(jiàn)同心環(huán)帶（圖2-B），結(jié)合變色栓菌形態(tài)特征[23]，將CS05鑒定為擔(dān)子菌門(mén)栓菌屬變色栓菌。

3.3 CS05對(duì)病原菌菌絲形態(tài)影響

掃描電鏡顯示，空白對(duì)照組尖孢鐮刀菌菌絲粗壯稠密，光滑均勻，整體平整飽滿，且排列有序（圖3-A、B、C）；經(jīng)CS05拮抗后，尖孢鐮刀菌菌絲較為稀疏，排列紊亂（圖3-D），菌絲出現(xiàn)纏繞（圖3-E箭頭處）、皺縮等現(xiàn)象（圖3-F箭頭處）。說(shuō)明CS05對(duì)尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)有較大的影響。

3.4 活性酶含量測(cè)定

結(jié)果表明，CS05能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β-1, 3-GA產(chǎn)量分別為（1.880 0±0.004 4）U/mg與（0.600 0±0.002 7）U/mg。CS05無(wú)菌發(fā)酵液與尖孢鐮刀菌菌絲體共培養(yǎng)4 h后，AKP活性顯著增強(qiáng)，4～6 h略有下降，6～12 h又出現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖4）。真菌胞外AKP活性增強(qiáng)可作為細(xì)胞壁被破壞的重要指標(biāo)之一[22]，方差分析顯示，共培養(yǎng)12 h后，CS05處理組AKP（10.06±0.88）U/L顯著大于對(duì)照組（4.72±1.31）U/L和陽(yáng)性對(duì)照組（5.27±0.71）U/L（＜0.05），表明CS05無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁的破壞可能是抗菌作用的重要機(jī)制之一。

A、B、C-對(duì)照組 D、E、F-CS05處理組

*表示0.05水平上有顯著差異，P＜0.05

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從24株內(nèi)生真菌中篩選得到一株能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的菌株CS05，鑒定為擔(dān)子菌門(mén)多孔菌目栓菌屬變色栓菌，該菌種序列已上傳至NCBI，Genbank號(hào)為：MZ030718，同時(shí)專利保藏于中國(guó)菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No.21948。為栓菌屬真菌，能夠分泌胞外氧化酶如木聚糖酶、錳過(guò)氧化物酶、漆酶等從而降解木質(zhì)素[24]，通常被用作商業(yè)化生產(chǎn)漆酶，作為有機(jī)污染物降解劑、農(nóng)藥污染降解劑、工業(yè)廢水降解劑等[25-26]。在植物病害的防治方面，Lorito等[27]曾利用從培養(yǎng)濾液中提純的蛋白質(zhì)組防治谷類(lèi)作物病原菌，結(jié)果表明的胞外蛋白質(zhì)組對(duì)的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的西紅花內(nèi)生真菌CS05對(duì)西紅花病原菌尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抗性，為西紅花球莖腐爛病的生物防治提供了菌種資源。

真菌細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生被認(rèn)為是抑制病原菌生長(zhǎng)的重要特性之一[28-29]。植物病原真菌的細(xì)胞壁主要組成成分為幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖等[30]，幾丁質(zhì)酶可以催化幾丁質(zhì)水解，在裂解真菌細(xì)胞壁、抑制真菌生長(zhǎng)的過(guò)程中起重要作用[31]，β-1,3-GA是一類(lèi)能特異作用于β-葡聚糖中β-1,3-糖苷鍵的水解酶，因此該酶的水解活性能夠抑制真菌的生長(zhǎng)與增殖[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，CS05能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β-1,3-GA，促進(jìn)了病原菌胞外AKP含量積累，這可能是加速病原菌細(xì)胞壁裂解，導(dǎo)致菌絲排列稀疏，出現(xiàn)皺縮、纏繞與萎蔫情況，最終導(dǎo)致病原菌死亡的原因。今后將對(duì)CS05在西紅花體內(nèi)定殖情況、與西紅花共生及對(duì)宿主生長(zhǎng)的影響、田間生防效果等進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為西紅花球莖腐爛病防治提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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LU Jie-miao1, ZHANG Jia-hao1, MING Qian-liang2, WANG Jie1, ZHOU Gui-fen1, ZHU Bo1, QIN Lu-ping1

1.School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China 2.Department of Pharmacognosy, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing 400038, China

To screen antagonistic fungi against corm rot pathogenic fungus of() and explore its antifungal mechanism.Twenty-four endophytic fungi isolated fromwere used to screen antagonistic fungi against corm rot pathogenic fungus via plate confrontation method.Molecular biological methods were used to identify the antagonistic strain.The antifungal mechanism was studied by scanning electron microscope, detecting the β-1,3-glucanase, chitinase and alkaline phosphatase activity.Eight endophytic fungi strains were screened since they possessed a significant antagonistic effect against.Among them, CS05 had the best inhibitory effect whose relative inhibitory rate was (76.53 ± 3.82)%.Moreover, CS05 was identified as.Enzyme activity assay showed that CS05 could produce β-1,3-glucanase and chitinase, and increase extracellular alkaline phosphatase content ofsignificantly, causing sparse and disordered growth, twining and shrinking ofmycelia.The endophytic fungus CS05 could effectively antagonize, which provided a reference for the biological control of corm rot of

L.; corm rot disease; endophytic fungi; antifungal activity; antagonistic mechanism; β-1,3-glucanase

R286.2

A

0253 - 2670(2022)10 - 3165 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.027

2021-11-06

浙江省一流學(xué)科（中藥學(xué)）開(kāi)放基金項(xiàng)目（ZYAOX2018011）；浙江省公益技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（LGN21H280001）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)人才專項(xiàng)（2021ZR09）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生青年創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（2022492838）

陸潔淼（1997—），女，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail: 201911114011486@zcmu.edu.cn

通信作者：朱 波，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参飪?nèi)生菌。E-mail: zhubo@zcmu.edu.cn

秦路平，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]