鄧冬杰，李 勵(lì)，談相云，孫 懿，王楚婷，鄭國(guó)華, 2，王桂紅*，胡俊杰*

淫羊藿素通過(guò)Akt/mTOR調(diào)控糖酵解抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究

鄧冬杰1，李 勵(lì)1，談相云1，孫 懿1，王楚婷1，鄭國(guó)華1, 2，王桂紅1*，胡俊杰1*

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065

探究淫羊藿素對(duì)人肝內(nèi)膽管癌HuCCT1細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。CCK-8法檢測(cè)淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞增殖活性的影響；平板克隆法檢測(cè)淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞集落形成能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞周期的影響；分光光度法檢測(cè)淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成量以及己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性的影響；Western blotting法檢測(cè)淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；Western blotting檢測(cè)淫羊藿素對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。淫羊藿素顯著抑制HuCCT1細(xì)胞的活力，并呈時(shí)間和劑量相關(guān)性；淫羊藿素呈劑量相關(guān)性地抑制HuCCT1細(xì)胞的集落形成（＜0.001）；淫羊藿素可以將HuCCT1細(xì)胞周期阻滯在G1期，并顯著降低增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（＜0.05）；淫羊藿素可以顯著降低HuCCT1細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP生成量（＜0.05、0.01、0.001）；淫羊藿素顯著抑制糖酵解相關(guān)酶（HK、PK）的活性以及蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001）；淫羊藿素顯著降低磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、磷酸化核糖體蛋白S6（phosphorylatedribosomal protein S6，p-RPS6）的蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；淫羊藿素顯著降低基因過(guò)表達(dá)的HuCCT1細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2的蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001）。淫羊藿素能夠抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控的糖酵解途徑有關(guān)。

淫羊藿素；肝內(nèi)膽管癌；增殖；糖酵解；蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的原發(fā)性惡性腫瘤，是繼肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）之后第2常見(jiàn)的肝惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的10%～15%[1]。臨床上主要以藥物化療為主，吉西他濱聯(lián)合鉑類仍是治療ICC的一線選擇，但會(huì)使患者出現(xiàn)不良反應(yīng)或產(chǎn)生耐藥性[2]。因此，尋找更加安全有效的藥物對(duì)臨床上治療ICC具有重要意義。

能量代謝的異常改變是腫瘤細(xì)胞的主要特征之一，這種代謝表型的特征是優(yōu)先依賴有氧糖酵解產(chǎn)生能量[3]。有研究表明，抑制腫瘤糖酵解途徑可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，甚至起到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用[4]。同時(shí)，研究證實(shí)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可以促進(jìn)糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取增強(qiáng)和糖酵解途徑異?；钴S，增加能量供應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖[5-7]。以上結(jié)果表明，Akt/mTOR信號(hào)通路與糖酵解密切相關(guān)。因此，抑制Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控的糖酵解途徑，降低腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，可以成為治療ICC的有效策略。

淫羊藿素是從中藥小檗科植物淫羊藿中分離得到的異戊二烯類黃酮衍生物。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死、干預(yù)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、抑制血管生成等途徑對(duì)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種癌癥起到抑制作用[8-12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿素可以抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的糖酵解，減少細(xì)胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但是，目前關(guān)于淫羊藿素對(duì)ICC的調(diào)控作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于腫瘤糖酵解途徑，以人肝內(nèi)膽管癌HuCCT1細(xì)胞為研究對(duì)象，探究淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為臨床開(kāi)發(fā)治療ICC的藥物提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

HuCCT1細(xì)胞購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)PS001091）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；Akt質(zhì)粒（pT3-EF1α-HA-myr-AKT1）由美國(guó)加州大學(xué)Chenxin實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；Neofect轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)D210102）購(gòu)自北京零客創(chuàng)智生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)AG29546226）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)J200033）、青霉素和鏈霉素（批號(hào)J120017）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；PBS緩沖液（批號(hào)MA0015-Jul-29G）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號(hào)2059461RP）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)KQ749）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；結(jié)晶紫（批號(hào)SLBP0250V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞周期試劑盒（批號(hào)EG20201109）購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)2021A1GE1011）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)710N0317）、乳酸含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200612）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211215）、己糖激酶（hexokinase，HK）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211116）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210610）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；M-PERTM哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑（批號(hào)VI311347）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)SI251119）、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)VF304274）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑（批號(hào)06021）、磷酸酶抑制劑（批號(hào)07121）均購(gòu)自康為世紀(jì)科技有限公司；兔源磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）單克隆抗體（批號(hào)ab109268）、兔源核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，RPS6）單克隆抗體（批號(hào)ab225676）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔源Akt多克隆抗體（批號(hào)10176-2-AP）、周期蛋白E1（Cyclin E1）單克隆抗體（批號(hào)11554-1-AP）、鼠源β-actin單克隆抗體（批號(hào)HRP-60008）購(gòu)自Proteintech公司；兔源磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）單克隆抗體（批號(hào)13038）、兔源磷酸化RPS6（phosphorylated RPS6，p-RPS6）單克隆抗體（批號(hào)4858）、兔源HK1單克隆抗體（批號(hào)2024）、兔源HK2單克隆抗體（批號(hào)2867）、兔源PKM1單克隆抗體（批號(hào)7067）、兔源PKM2單克隆抗體（批號(hào)4053）、兔源增殖細(xì)胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（批號(hào)13110）、兔源Cyclin D1單克隆抗體（批號(hào)2978）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)7074）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)7076）購(gòu)自美國(guó)CST公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠試劑盒（批號(hào)18D250）購(gòu)自美國(guó)EpiZyme Scientific公司；其余試劑為分析純，水為去離子水。

1.3 儀器

MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；VCX750型超聲波破碎儀（美國(guó)Sonics公司）；CKX31型倒置顯微鏡、TC20型細(xì)胞計(jì)數(shù)器（日本Olympus公司）；Trans-Blot TurboTM型全能型蛋白轉(zhuǎn)膜儀、Power Pac Basic型電泳儀、xMark型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Centrifuge 5424R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；XB220A型分析天平（瑞士Precisa公司）；G-BOX型成像分析系統(tǒng)（英國(guó)Syngene公司）；Vortex-Genie2型漩渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；NovoCyte D2060R型流式細(xì)胞儀（艾森生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿素母液的配制

精密稱取淫羊藿素3.68 mg溶于2 mL DMSO中，配成濃度為5 mmol/L的淫羊藿素母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，避光保存于4 ℃，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HuCCT1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuCCT1細(xì)胞，以5000個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)置藥物組、對(duì)照組（不含藥物）和空白組（只含空白培養(yǎng)基）。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，藥物組加入一系列濃度梯度的淫羊藿素，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。每個(gè)劑量設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算淫羊藿素給藥24、48 h的半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值，根據(jù)IC50值設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞集落形成能力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuCCT1細(xì)胞，以1000個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）和低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)14 d，每2天換液，直至形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，倒掉染液，放入清水中清洗干凈殘留在6孔板中的染液，瀝干水分。相機(jī)拍攝記錄每孔集落的大致情況，于顯微鏡下計(jì)數(shù)1 cm2正方格內(nèi)細(xì)胞集落數(shù)（黏連在一起的多個(gè)細(xì)胞落算作多個(gè)，邊角處數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右），再乘以每孔的面積即為總的細(xì)胞集落數(shù)。

2.5 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞周期的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuCCT1細(xì)胞，接種于直徑為5 cm的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，加入PBS清洗2次。設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）和低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。給藥24 h后收集細(xì)胞，加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS重懸，離心沉淀細(xì)胞，棄去上清。加入1 mL在4 ℃冰浴預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，于4 ℃固定細(xì)胞2 h。離心沉淀細(xì)胞，棄去乙醇。每個(gè)樣品加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞。錫箔紙包裹EP管避光，于37 ℃孵育30 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量的影響

細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組以及給藥濃度同“2.5”項(xiàng)下方法。給藥24 h后收集細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)量細(xì)胞數(shù)。離心后收集細(xì)胞，按照試劑盒操作步驟，采用酶標(biāo)儀分別在555 nm（葡萄糖）、570 nm（乳酸）、340 nm（ATP）處檢測(cè)值，計(jì)算葡萄糖消耗量、乳酸生成量和ATP生成量。

2.7 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞HK和PK活性的影響

細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組以及給藥濃度同“2.5”項(xiàng)下方法。給藥24 h后收集細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)量細(xì)胞數(shù)。離心收集細(xì)胞至EP管中，棄上清。按照試劑盒操作步驟，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)340 nm處的值，計(jì)算HK和PK的活性。

2.8 淫羊藿素對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Akt基因質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuCCT1細(xì)胞，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)置對(duì)照組、模型組和淫羊藿素低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）組。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。先將基因質(zhì)粒與不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋并充分混勻，在質(zhì)粒稀釋液中加入Neofect轉(zhuǎn)染試劑（培養(yǎng)基∶質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑＝1 mL∶1 μg∶1 μL），輕輕混勻，室溫靜置15～30 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)。

2.9 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞周期、增殖以及糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)

從細(xì)胞中分離出總蛋白，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入Cyclin D1、Cyclin E1、PCNA、p-Akt、Akt、p-mTOR、p-RPS6、RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2和β-actin抗體孵育過(guò)夜；然后用TBST緩沖溶液清洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h后，用TBST緩沖溶液清洗3次，每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)，并于G-BOX成像分析系統(tǒng)獲得蛋白免疫印記圖。采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，以相對(duì)灰度值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)采用檢驗(yàn)比較，多組間均數(shù)采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，淫羊藿素（40、60、80 μmol/L）組24、48 h的細(xì)胞存活率均明顯降低，并呈時(shí)間和劑量相關(guān)性，其IC50值為50.48 μmol/L。參考以上結(jié)果，故確定12.5、25.0、50.0 μmol/L作為淫羊藿素的給藥劑量，并選擇作用24 h作為淫羊藿素的給藥條件。

圖1 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

3.2 淫羊藿素抑制HuCCT1細(xì)胞集落形成能力

如圖2所示，與對(duì)照組比較，淫羊藿素（12.5、25.0、50.0 μmol/L）組細(xì)胞克隆形成數(shù)均顯著降低（＜0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明淫羊藿素能夠抑制HuCCT1細(xì)胞的集落形成能力，即抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖。

3.3 淫羊藿素將HuCCT1細(xì)胞周期阻滯于G1期

不同濃度的淫羊藿素處理細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組比較，隨著淫羊藿素濃度的增加，處于G1期的HuCCT1細(xì)胞數(shù)量顯著增加（＜0.05、0.01），表明淫羊藿素可將HuCCT1細(xì)胞周期阻滯于G1期。隨后檢測(cè)了G1期的特異性周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1以及增殖蛋白PCNA的表達(dá)水平，相比于對(duì)照組，淫羊藿素組細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E1和PCNA的表達(dá)水平均有所降低，且高劑量更為顯著（＜0.05）。

3.4 淫羊藿素抑制HuCCT1細(xì)胞中葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量

如圖4所示，與對(duì)照組相比，淫羊藿素顯著抑制HuCCT1細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖2 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞集落形成的影響(, n = 3)

圖3 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞周期(A) 和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)(B) 的影響(, n = 3)

圖4 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量的影響(, n = 3)

3.5 淫羊藿素抑制HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)及活性

如圖5-A所示，與對(duì)照組相比，淫羊藿素給藥組中糖酵解途徑相關(guān)酶HK1、HK2、PKM1、PKM2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），表明淫羊藿素可以抑制糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)水平。由于糖酵解進(jìn)程不僅與酶的含量有關(guān)，也與酶的活力有關(guān)，因此進(jìn)一步檢測(cè)了淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶活力的影響。如圖5-B所示，淫羊藿素處理細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，HK和PK的活力均顯著降低（＜0.01），并呈劑量相關(guān)性。

圖5 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞HK、PK蛋白表達(dá)(A) 及活性(B) 的影響(, n = 3)

3.6 淫羊藿素抑制HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路的活化

如圖6所示，淫羊藿素處理細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，p-Akt、p-mTOR、p-RPS6蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Akt、RPS6蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異，表明淫羊藿素抑制HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路的活化。

3.7 淫羊藿素抑制瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Akt基因質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步探究淫羊藿素調(diào)控HuCCT1細(xì)胞糖酵解的作用機(jī)制，對(duì)HuCCT1細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒來(lái)激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路，并檢測(cè)其下游糖酵解途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)。Western blotting結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞模型組中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2等蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001），表明轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路被激活，并進(jìn)一步促進(jìn)其下游糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒的模型組相比，不同濃度的淫羊藿素給藥24 h后，p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2等蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），表明淫羊藿素可以通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)調(diào)控HuCCT1細(xì)胞的糖酵解途徑。

圖6 淫羊藿素對(duì)HuCCT1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖7 淫羊藿素對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Akt質(zhì)粒的HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，淫羊藿素是一種新型的抗癌藥物，可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤的發(fā)展[14]。Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)淫羊藿素呈劑量和時(shí)間依賴的方式抑制肝癌PLC、PRF/5、Huh7細(xì)胞的活力，這種抑制活性是通過(guò)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/Janus激酶2（Janus kinase 3，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路發(fā)揮作用的。在腎細(xì)胞癌細(xì)胞中，淫羊藿素可降低Cyclin D、CyclinE1等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。同時(shí)，在三陰性乳腺癌中，淫羊藿素也可以通過(guò)抑制雌激素受體-α36（estrogen receptor-α36，ER-α36）介導(dǎo)的有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號(hào)傳導(dǎo)和雌激素對(duì)Cyclin D1的誘導(dǎo)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿素呈時(shí)間和劑量依賴性地抑制HuCCT1細(xì)胞的活性，并有效抑制HuCCT1細(xì)胞的克隆形成。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，淫羊藿素能將HuCCT1細(xì)胞的周期阻滯于G1期，并降低HuCCT1細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E1的表達(dá)水平。然而具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此在后續(xù)研究中進(jìn)行了進(jìn)一步探索。

腫瘤細(xì)胞中葡萄糖代謝的主要特征為葡萄糖攝取量增加和有氧糖酵解[3]。盡管有氧糖酵解在ATP凈產(chǎn)量方面不如氧化磷酸化，但其產(chǎn)能快捷，可以滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)快速增殖的能量需求[17]。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也會(huì)通過(guò)增加葡萄糖攝取來(lái)促進(jìn)糖酵解途徑。高水平的糖酵解為腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖快速提供了能量，而此過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物也成為了促進(jìn)腫瘤增殖的誘因。糖酵解途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)水平增強(qiáng)或活性增加是腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑異常活躍的主要原因之一[4]。HK作為糖酵解過(guò)程中的重要限速酶，可以將進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸-葡萄糖（glucose 6-phosphate，G6P），在多種癌癥中表達(dá)異常升高[18]。PK是糖酵解過(guò)程最后一步的標(biāo)志性限速酶，負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)中的磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽和ATP以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[19-20]。該酶在多種腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，其中的1個(gè)亞型PKM2在ICC中高表達(dá)，因此被作為ICC的預(yù)測(cè)標(biāo)志[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可以顯著降低HuCCT1細(xì)胞中葡萄糖攝取量、乳酸生成量以及ATP生成量，并且也可以降低HK、PK的酶活力。同時(shí)，不同濃度的淫羊藿素給藥干預(yù)后，HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白HK1、HK2、PKM1、PKM2蛋白的表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明淫羊藿素可以降低HuCCT1細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)水平及活力，抑制糖酵解途徑，減少葡萄糖攝取量、乳酸生成量和ATP生成量。另外，有研究表明，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的糖酵解，可以使細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)升高，刺激腫瘤細(xì)胞增殖[23]。說(shuō)明淫羊藿素可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的糖酵解，阻斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而有效抑制ICC細(xì)胞快速增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)糖酵解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]。Akt是腫瘤糖酵解表型的重要驅(qū)動(dòng)因素，并通過(guò)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和膜易位以及磷酸化關(guān)鍵糖酵解酶來(lái)調(diào)控糖酵解[25]。同時(shí)，Akt可被磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）磷酸化而激活，活化的Akt可以激活下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子mTORC并可與Raptor結(jié)合形成mTOR復(fù)合物1。mTORC1可以磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶進(jìn)而激活RPS6來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成用于腫瘤細(xì)胞增殖[2]。另外，活化的mTORC1也可以通過(guò)調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子影響糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)水平[25]。本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿素可以降低HuCCT1細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6等Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，因此推測(cè)淫羊藿素可能通過(guò)Akt/mTOR調(diào)控HuCCT1細(xì)胞的糖酵解途徑。為了進(jìn)一步探究淫羊藿素是否是通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)調(diào)控HuCCT1細(xì)胞糖酵解抑制其增殖。本研究在HuCCT1細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)，并通過(guò)Western blotting檢測(cè)Akt/mTOR信號(hào)通路以及其下游的糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在HuCCT1細(xì)胞中，Akt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)激活后可以使其下游的HK1、PKM1、HK2、PKM2等糖酵解關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平顯著升高。而在采用淫羊藿素干預(yù)24 h后，HuCCT1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這說(shuō)明淫羊藿素可以通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控HuCCT1細(xì)胞糖酵解，進(jìn)而抑制其增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果表明淫羊藿素可能通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路，阻斷細(xì)胞糖酵解，限制腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，將細(xì)胞阻滯于G1期，進(jìn)而抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖。今后將進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入研究淫羊藿素的作用機(jī)制，為淫羊藿素治療肝內(nèi)膽管癌的藥物研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of icaritin on inhibiting proliferation of intrahepatic cholangiocarcinoma cells by Akt/mTOR-mediated glycolysis

DENG Dong-jie1, LI Li1, TAN Xiang-yun1, SUN Yi1, WANG Chu-ting1, ZHENG Guo-hua1, 2, WANG Gui-hong1, HU Jun-jie1

1.School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2.Key Laboratory of Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, Ministry of Education, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

To investigate the effect and mechanism of icaritin on proliferation of human intrahepatic cholangiocarcinoma HuCCT1 cells.CCK-8 method was used to detect the effect of icaritin on proliferation activity of HuCCT1 cells.Plate cloning method was used to detect the effect of icaritin on colony formation ability of HuCCT1 cells.Flow cytometry was used to detect the effect of icaritin on cell cycle of HuCCT1 cells.Spectrophotometric method was used to detect the effect of icaritin on glucose uptake, lactate production and adenosine triphosphate (ATP) production of HuCCT1 cells and activities of hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK) in cells.Western blotting was used to detect the effect of icaritin on expression levels of proliferation-related proteins, protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway and glycolysis-related proteins in HuCCT1 cells.Western blotting was used to detect the effect of icaritin on expression levels of Akt/mTOR and glycolysis-related proteins in HuCCT1 cells transiently transfected withplasmids.Icaritin significantly inhibited the viability of HuCCT1 cells in a time-and dose-dependent manner.Icaritin significantly inhibited the colony formation of HuCCT1 cells in a dose-dependent manner (< 0.001).Icaritin blocked cell cycle of HuCCT1 in G1phase, and significantly reduced the expression levels of proliferation-related proteins (< 0.05).Icaritin significantly reduced glucose uptake, lactate production and ATP production in HuCCT1 cells (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin significantly inhibited the activities of glycolysis-related enzymes and protein expression levels (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin significantly reduced the expression levels of phosphorylated Akt (p-Akt), phosphorylated mTOR (p-mTOR) and phosphorylated ribosomal protein S6 (p-RPS6) (< 0.05, 0.01).Icaritin significantly reduced the expression levels of p-Akt p-mTOR, p-RPS6, HK1, HK2, PKM1 and PKM2 in HuCCT1 cells over-expressinggene (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin can inhibit the proliferation of HuCCT1 cells, and its mechanism may be related to Akt/mTOR-mediated glycolysis pathway.

icaritin; intrahepatic cholangiocarcinoma; proliferation; glycolysis; protein kinase B/mammalian target of rapamycin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3061 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.016

2022-01-18

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2020CFB523）

鄧冬杰（1997—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型的研究。Tel: 15926974750 E-mail: 1819493671@qq.com

通信作者：胡俊杰（1984—），男，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。 Tel: 13407126284 E-mail: hero0712@163.com

王桂紅（1964—），女，碩士生導(dǎo)師，主任藥師，主要從事中藥新制劑、新劑型的研究。Tel: 18986026269 E-mail: 843773585@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]