黃淑蕓，許 萍，洪宗元，鐘樹志

安石榴苷改善小鼠細菌性腸炎及調(diào)節(jié)腸道菌群的實驗研究

黃淑蕓，許 萍，洪宗元，鐘樹志*

皖南醫(yī)學院組織胚胎學教研室，安徽 蕪湖 241002

研究安石榴苷對細菌性腸炎的改善作用及對腸道菌群的影響。45只BALB/c小鼠采用致病性大腸桿菌O101建立細菌性腸炎模型，給予安石榴苷或頭孢克肟干預7 d，給藥過程中觀察各組小鼠的體征并計算每天的疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）與體質(zhì)量變化率；給藥結(jié)束后取腸組織及腸道內(nèi)容物，蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠腸組織的病理改變；免疫組化法檢測小鼠小腸組織黏膜中閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）和緊密連接蛋白（Occludin）的表達；測定小鼠腸組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性；qRT-PCR法檢測小鼠腸壁炎癥相關因子核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide binding oligomerization domain 2，）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）和白細胞介素-6（interleukin-6，）mRNA的表達；ELISA法檢測小鼠血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、TNF-α和IL-6水平；16S rDNA高通量測序法檢測小鼠腸道菌群多樣性和豐度。與模型組比較，安石榴苷組小鼠DAI評分顯著降低（＜0.01）；小腸黏膜充血、水腫明顯減輕；小腸上皮中ZO-1和Occludin蛋白表達顯著增多（＜0.01）；腸壁MPO活性顯著降低（＜0.01）；腸壁、、和mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）；血清LPS、TNF-α和IL-6水平顯著減少（＜0.01）；腸道厚壁菌門（Firmicutes）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和Clostridiales-unclassified相對豐度顯著升高（＜0.01），變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Muribaculaceae和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）菌群相對豐度顯著降低（＜0.05、0.01）。安石榴苷能夠改善致病性大腸桿菌O101誘導的腸炎，減輕小鼠腸壁的炎癥反應，保護腸黏膜屏障，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群有關。

安石榴苷；細菌性腸炎；腸道菌群；腸黏膜屏障；炎癥反應

細菌性腸炎是消化系統(tǒng)常見病，是由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌感染引起的急性腸道炎癥，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹痛腹瀉等癥狀，該病在各類人群中均會發(fā)生，但在小兒中發(fā)病率最高。久治不愈可導致小兒營養(yǎng)成分失衡，嚴重可威脅到患兒生命健康[1-3]。臨床上多以抗菌治療為主，抗生素常用于治療由病原感染引起的腹瀉，然而由于耐藥菌株的出現(xiàn)，常需更換敏感的抗生素，由此會引起腸道菌群的失調(diào)從而導致腹瀉加重[4-5]。因此，開發(fā)和尋找抗腹瀉的新藥成為必然。

中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的瑰寶，有些中藥具有毒性小、抗腹瀉效果較好的特點，對于腸炎腹瀉類疾病的治療，我國古籍典藏也多有記載[6-7]。石榴，亦名安石榴。《本草綱目》記載：“石榴皮，澀腸止痢之藥也。能治久痢虛滑不禁，并婦人血崩，帶下諸疾，又安蛔蟲”，在臨床上主要用于胃脘寒痛、消化不良[8-9]。安石榴苷作為石榴皮中最主要的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種活性[10-11]，臨床研究表明，安石榴苷可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，降低腸道癌癥、腹瀉和胃部疾病發(fā)生率[12]。研究表明，安石榴苷能夠顯著影響金黃色葡萄球菌的細胞壁完整性及細胞膜通透性，且對菌體蛋白具有一定抑制作用[13]；安石榴苷在C57BL/6小鼠煙曲霉菌性角膜炎中可以降低真菌數(shù)量，抑制巨噬細胞的數(shù)量和分泌炎癥因子的功能，從而降低真菌性角膜炎的炎癥評分以及抑制炎癥相關因子的表達[14]。這些研究證實，安石榴苷對致病菌具有選擇性毒性，從而調(diào)節(jié)微生物失衡。然而，安石榴苷能否通過對致病菌的選擇毒性調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減輕細菌性腸炎尚未見文獻報道。本研究對致病性大腸桿菌誘導腸炎小鼠予以安石榴苷治療，探究安石榴苷對細菌性腸炎的作用以及對腸道菌群的影響，為闡明中藥治療腸炎的作用機制提供初步的實驗依據(jù)，并且為腸炎的中藥開發(fā)打開新的思路。

1 材料

1.1 動物

SPF級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量（22±3）g，由南京青龍山動物養(yǎng)殖基地提供，動物許可證號SCXK（蘇）2021-0001。動物常規(guī)飼養(yǎng)于皖南醫(yī)學院實驗動物中心，相對濕度40%～70%，室溫（23±2）℃，晝夜交替照明，自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。動物實驗通過皖南醫(yī)學院實驗動物倫理委員會的批準，批準文號為LLSC-2021-141。

1.2 藥品與試劑

安石榴苷凍干粉（批號P0349，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自純優(yōu)生物有限公司；致病性大腸桿菌O101（批號BNCC186732C）購自北納生物科技有限公司；頭孢克肟顆粒（批號H10940128，50 mg/粒）購自廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒（批號10071325）購自美國賽默飛公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（批號A044-1-1）購自南京建成生物工程研究所；閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）兔抗小鼠一抗（批號ab190085）、緊密連接蛋白（Occludin）兔抗小鼠一抗（批號ab216327）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號ab150077）購自英國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號分別為EK201/2、EK206/3、EK282/3；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide binding oligomerization domain 2，）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，）、、、引物由華大基因有限公司合成。

1.3 儀器

JW-318HR型高速運轉(zhuǎn)的臺式冷凍離心機（美國賽默飛公司）；Lepgen-96型PCR擴增儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；qRT-PCR儀（哲羅姆生物科技有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；RT-6000型酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

2 方法

2.1 腹瀉模型的建立、分組及給藥

致病性大腸桿菌O101在液體肉湯培養(yǎng)基中以180 r/min、37 ℃在搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集的細菌5000 r/min離心5 min，并在PBS中洗滌3次，然后將細菌沉淀物重新懸浮到PBS中，調(diào)整到2.6×108CFU/mL的終濃度，備用。取BALB/c小鼠45只，雌雄各半，將備好的致病性大腸桿菌O101懸液（10 mL/kg）建立腸炎模型，并將腸炎模型小鼠隨機分為模型組、安石榴苷（25 mg/kg）組和頭孢克肟（3 mg/kg）組，另取15只正常小鼠作為對照組。給藥組于造模當天開始ig以PBS溶解的相應藥物，每日10: 00給藥1次，連續(xù)7 d。

2.2 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分

整個實驗期間，每日觀察并記錄小鼠的一般情況，包括精神狀況、活動、小鼠的糞便性狀及便血情況，按表1標準，計算DAI評分。

DAI＝(體質(zhì)量下降分值＋糞便性狀分值＋便血情況分值)/3

表1 DAI評分標準

糞便性狀分值的評分依據(jù)為黏著于肛門的水樣便為稀便，不黏著于肛門的糊狀水樣便為半稀便，成型大便為正常便

Score of fecal character score is based on watery stool that adheres to anus as loose stool, mushy watery stool that does not adhere to anus is semi-loose stool, and formed stool is normal stool

2.3 標本采集

給藥結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，離心分離血清，備用。小鼠頸椎脫臼處死，打開腹腔，剪開腸管，取腸道內(nèi)容物置無菌EP管凍存待測腸道菌群，另取距胃10 cm小腸6 cm，前1/3段提取RNA檢測炎癥因子mRNA表達，中1/3段制作勻漿檢測炎癥因子，后1/3段置4%甲醛充分固定。

2.4 蘇木素-伊紅（HE）與免疫組化染色

取固定好的小腸管，石蠟包埋，切5 μm厚切片，常規(guī)HE染色。另取切成厚度為5 μm的腸組織切片，加入H2O2，常溫孵育10 min，漂洗后加入5%牛血清白蛋白，常溫孵育60 min，滴加兔抗小鼠一抗ZO-1（1∶150）、Occludin（1∶150），4 ℃孵育過夜；漂洗后，加入HRP標記的化羊抗兔IgG二抗（1∶100），室溫孵育60 min后沖洗，加入DAB顯色液，顯色完畢后用中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色的平均吸光度（）值。

2.5 MPO活性檢測

取新鮮腸組織，研磨充分后，PBS洗滌收集，離心取上清，按照MPO試劑盒說明書測定各組樣品MPO活性。

2.6 qRT-PCR檢測炎性因子mRNA表達

取凍存的小腸50 mg，加入1 mL TRNzol，按說明書提取總RNA，Nanodrop 2000測定RNA的濃度和純度，根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA和擴增。反應體系為25 μL，反應參數(shù)：94 ℃預熱3 min，45個循環(huán)（94 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，熒光采集，72 ℃延伸30 s）。引物序列見表2。

表2 引物序列

2.7 ELISA法檢測血清中LPS、IL-6和TNF-α水平

取分離的血清，按ELISA試劑盒說明書檢測血清中LPS、IL-6和TNF-α水平。

2.8 腸道菌群的分析測定

對收集的各組小鼠糞便進行16S rDNA高通量測序。提取糞便中細菌的總DNA，取用10 ng的DNA模板，依據(jù)16S rDNA V3～4區(qū)序列，用帶Barcode的特異引物進行PCR擴增。用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，將構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和qRT-PCR定量，文庫合格后，運用HiSeq2500 PE250進行上機測序。得到有效數(shù)據(jù)后，選取可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）代表性序列，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化。

2.9 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠體質(zhì)量變化率的影響

小鼠ig致病性大腸桿菌O101懸液后12 h左右出現(xiàn)腹瀉癥狀，小鼠精神倦怠，飲食量減少，毛發(fā)無光澤，排黃色稀便，有分泌物流出。與對照組相比，模型組小鼠飲食減少，活動能力下降，毛色無光澤，體質(zhì)量下降；自給藥第4天，體質(zhì)量下降較對照組有統(tǒng)計學意義（＜0.05、0.01，圖1-A）；與模型組比較，自給藥第5天，各給藥組小鼠體質(zhì)量顯著增加（＜0.05、0.01）。

3.2 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠DAI評分的影響

各組小鼠從造模開始后每天固定時間進行DAI評分，如圖1-B所示，與對照組相比，從第2天起，模型組小鼠DAI評分顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組DAI評分顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸壁MPO活性的影響

MPO是評價組織中中性粒細胞浸潤程度的重要指標，能夠有效反映炎癥狀況。如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠腸壁MPO活性明顯升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠腸壁MPO活性明顯降低（＜0.01）。

圖2 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠小鼠腸壁MPO活性的影響(, n = 15)

3.4 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸壁炎性因子mRNA表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組小鼠腸壁、、和mRNA表達水平明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠腸壁、、和mRNA表達水平明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.5 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠血清LPS、IL-6和TNF-α水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中LPS、IL-6和TNF-α水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中LPS、IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.01）。

3.6 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠小腸腸壁屏障的影響

如圖4所示，對照組小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整無潰瘍，小腸絨毛排列緊密有規(guī)則，上皮細胞形態(tài)正常；與對照組比較，模型組小鼠腸壁可見明顯潰瘍，絨毛密度稀疏，排列紊亂，且有不同程度的脫落；黏膜層腸腺及上皮完全喪失，并伴有大量炎性細胞浸潤，炎癥侵及黏膜下層及肌層；各給藥組小鼠腸壁上皮細胞脫落現(xiàn)象較輕，絨毛排列較為整齊，炎性細胞浸潤減少，感染癥狀明顯減輕。

圖3 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸壁炎性因子mRNA表達的影響(, n = 15)

Table 3 Effect of punicalagin on inflammatory factor mRNA expressions in intestinal wall of mice with bacterial enteritis (, n = 15)

表3 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠血清LPS、IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 15)

Table 3 Effect of punicalagin on LPS, IL-6 and TNF-α levels in serum of mice with bacterial enteritis (, n = 15)

Table 3 Effect of punicalagin on inflammatory factor mRNA expressions in intestinal wall of mice with bacterial enteritis (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)LPS/(EU·mL?1)IL-6/(pg·mL?1)TNF-α/(pg·mL?1) 對照—0.08±0.158.6±1.62.8±0.3 模型—5.95±0.22##29.7±2.6##10.6±2.4## 頭孢克肟32.62±0.12**20.2±2.2**5.8±1.2** 安石榴苷251.85±0.16**15.2±1.3**4.2±0.6**

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表4同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as table 4

圖4 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠小腸腸壁病理變化的影響(HE, ×150)

緊密連接蛋白Occludin、ZO-1是形成腸上皮細胞之間緊密連接的重要成分，主要表達在上皮細胞側(cè)面頂端胞質(zhì)中，對維持腸壁的完整性發(fā)揮重要作用。免疫組化染色圖（圖5）中，棕褐色為Occludin、ZO-1陽性表達。對照組腸上皮中Occludin、ZO-1蛋白表達較多；與對照組相比，模型組小鼠腸壁蛋白表達顯著減少（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠腸壁蛋白表達顯著增多（＜0.01）。

3.7 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸道菌群的影響

3.7.1 對小鼠腸道菌群多樣性的影響 從4個樣本中共得到5813個OTUs。Venn圖結(jié)果表明358個OTUs為4組共同擁有，其中對照組與模型組之間共同擁有571個OTUs，模型組與安石榴苷組之間共同擁有632個OTUs，模型組和頭孢克肟組共同擁有667個OTUs，見圖6-A。Shannon指數(shù)結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠腸菌多樣性顯著降低（＜0.05）；與模型組相比，各給藥組小鼠腸菌多樣性顯著升高（＜0.05），見圖6-B。主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）結(jié)果表明，4組間腸道菌群結(jié)構(gòu)均存在顯著差異，見圖6-C。

3.7.2 對小鼠腸道菌群豐度的影響 由門、科水平熱圖（圖7-A、B）、構(gòu)成比堆積圖（圖7-C、D）和表4可知，各組小鼠的腸道菌群有明顯不同。與對照組相比，模型組小鼠變形菌門（Proteobacteria）、Muribaculaceae和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）菌群相對豐度顯著升高（＜0.05、0.01），厚壁菌門（Firmicutes）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、Clostridiales_unclassified菌群相對豐度明顯下降（＜0.05、0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠腸道厚壁菌門、毛螺菌科、Clostridiales_unclassified菌群相對豐度顯著升高（＜0.05、0.01），擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門、Muribaculaceae和脫硫弧菌科菌群相對豐度顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖5 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠小腸腸壁緊密連接蛋白表達的影響小鼠(免疫組化, ×200)

圖6 各組OTUs韋恩圖(A)、Shannon指數(shù)(B) 和PCoA分析(C)

4 討論

急性細菌性腹瀉是臨床上最常見的消化道感染性疾病之一，引起該病的常見致病菌有大腸埃希菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌等，多為革蘭陰性桿菌[15]。研究表明，革蘭陰性桿菌感染機體后，其產(chǎn)生的內(nèi)毒素將激活炎癥信號轉(zhuǎn)導通路，誘導機體合成并釋放TNF-α、IL-8等炎癥因子[16]。頭孢克肟屬于臨床上常用的廣譜抗生素之一，為頭孢菌素類抗生素，有廣泛的抗菌作用，可抑制DNA合成和復制，從而起到殺菌的功效，是治療細菌性腸炎的首選抗生素，但頭孢克肟不適于長期應用，會使患者體內(nèi)出現(xiàn)嚴重的菌群紊亂癥狀，誘發(fā)其他并發(fā)癥[17]。因此，深入研究細菌性腸炎發(fā)病的分子機制，積極尋找有效的抗腸炎藥物具有重要的意義。本研究通過小鼠ig致病性大腸桿菌O101制備急性細菌性腸炎模型，記錄小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況，計算評分DAI。結(jié)果顯示，模型組小鼠DAI評分顯著升高，表明腸炎模型成功建立；安石榴苷和頭孢克肟治療后，小鼠DAI評分明顯降低，表明安石榴苷能改善致病菌引起的小鼠腸炎。

圖7 小鼠腸道內(nèi)容物菌群在門、科水平上物種組成熱圖 (A、B) 和柱狀堆疊圖 (C、D)

表4 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸道菌群相對豐度的影響(, n = 3)

Table 4 Effect of punicalagin on relative abundance of intestinal flora of mice with bacterial enteritis (, n = 3)

表4 安石榴苷對細菌性腸炎小鼠腸道菌群相對豐度的影響(, n = 3)

組別劑量/(mg·kg?1)相對豐度/% 厚壁菌門擬桿菌門變形菌門Muribaculaceae毛螺菌科Clostridiales_unclassified脫硫弧菌科 對照—39.9±2.249.0±1.85.2±0.638.1±1.920.6±1.25.8±0.65.0±0.4 模型—29.2±5.2#47.4±6.117.1±3.6##42.6±2.0#11.6±2.8#2.9±0.8##15.0±2.3## 安石榴苷2578.8±4.1**16.0±4.0**2.1±1.1**12.1±3.2*45.5±4.1**14.7±2.7**2.0±0.3** 頭孢克肟363.3±4.2**28.8±2.2*2.7±0.2*21.3±3.9*37.7±3.5**11.6±1.9**2.5±0.2**

MPO是中性粒細胞的標志分子[18]。小鼠ig致病性大腸桿菌O101后，腸壁組織MPO活性顯著升高，可見造模后小鼠腸道菌群失衡，腸壁產(chǎn)生炎癥，免疫系統(tǒng)激活。腸壁病理切片也表明，腸絨毛中軸和腸腺周邊固有層粒細胞浸潤，小腸上皮局部脫落，絨毛排列紊亂，腸壁炎癥反應明顯。安石榴苷和頭孢克肟治療后可顯著減輕腸壁炎癥反應。

通常情況下，腸道微生物群共生并相互作用，形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)；同時，它們參與腸道食物的消化與吸收，以及直接或間接參與腸黏膜固有或獲得性免疫應答。腸道微生物種群平衡的破壞，不僅影響食物的消化和吸收，而且可能破壞腸道免疫功能，引起強烈的炎癥反應，導致腸壁病變[19-22]。本研究中，小鼠ig致病性大腸桿菌O101后，腸道原有的微生態(tài)平衡被打破，腸道厚壁菌門、毛螺菌科和Clostridiales_unclassified菌群豐度顯著降低，變形菌門、Muribaculaceae和脫硫弧菌科菌群豐度顯著升高。厚壁菌門、毛螺菌科、Clostridiales_ unclassified都是化能營養(yǎng)型細菌，有利營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，該類型細菌豐度降低，常導致消化不良；變形菌門、擬桿菌門、Muribaculaceae和脫硫弧菌科細菌是條件致病菌，與炎癥性腸病的發(fā)生高度相關。安石榴苷與頭孢克肟可顯著改善腸道微生態(tài)平衡，增加厚壁菌門、毛螺菌科、Clostridiales_ unclassified細菌豐度，降低變形菌門、擬桿菌門、Muribaculaceae和脫硫弧菌科菌群豐度。

腸黏膜屏障包括生物屏障、免疫屏障與機械屏障。生物屏障也就是腸道菌群，其構(gòu)成了一個對抗病原體的保護屏障；免疫屏障即腸相關淋巴組織、腸道內(nèi)漿細胞分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）在內(nèi)的免疫系統(tǒng)；機械屏障由腸黏膜上皮細胞以及細胞間的緊密連接構(gòu)成。腸壁屏障蛋白（ZO-1和Occludin）是緊密連接的重要組成部分，緊密連接能夠調(diào)節(jié)和維持細胞極性，起到連接與封閉細胞的作用，與腸屏障通透性直接相關。多種病原體通過破壞ZO-1或Occludin蛋白結(jié)構(gòu)改變屏障通透性與腸道完整性以穿過細胞旁連接進入機體[23-25]。腸上皮屏障若被破壞，可導致腸道菌群不受調(diào)節(jié)的移動進入固有層，病原微生物（如致病性大腸桿菌）釋放的表面抗原（如LPS）被腸壁抗原提呈細胞Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和NOD2受體識別，活化NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）等促炎因子，啟動包括NF-κB在內(nèi)的炎癥通路，促進IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，激活腸道相關的淋巴組織，產(chǎn)生局部組織的炎性反應[26-28]。同時IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子與機會致病菌協(xié)同損傷腸壁屏障蛋白（ZO-1和Occludin），使得細胞間的緊密連接松動，腸屏障通透性增高。LPS通過損傷的腸上皮進入腸壁和血液，誘導腸壁炎癥因子相關基因表達上調(diào)，導致血液內(nèi)的LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子增多，影響整個機體系統(tǒng)[29-30]。本研究結(jié)果顯示，安石榴苷改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)，顯著下調(diào)腸炎小鼠腸壁、和mRNA表達水平，減輕炎癥因子對腸壁屏障蛋白的破壞，導致進入血液的LPS、IL-6和TNF-α顯著減少。

綜上所述，安石榴苷能夠改善致病性大腸桿菌O101誘導的細菌性腸炎，減輕小鼠腸壁的炎癥反應，保護腸壁屏障，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群有關。本研究為闡明安石榴苷治療腸炎的作用機制提供了一定的實驗依據(jù)，也為開發(fā)治療腸炎的中藥提供了有益的啟示。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Experimental study on improvement of bacterial enteritis and regulation of intestinal flora in mice by punicalagin

HUANG Shu-yun, XU Ping, HONG Zong-yuan, ZHONG Shu-zhi

Department of Histology and Embryology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China

To study the improvement effect of punicalagin on bacterial enteritis and its influence on intestinal flora.Forty-five BALB/c mice were ig pathogenicO101to establish a bacterial enteritis model, and were given punicalagin or cefixime for 7 d of intervention.During the administration, signs of mice in each group were observed, daily disease activity index (DAI) and body weight change rate were calculated; Intestinal tissue and intestinal contents were collected after administration, and hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of intestinal tissue in mice; Expressions of tight junction protein zonula occludens-1 (ZO-1) and Occludin in small intestine were detected by immunohistochemistry; Activity of myeloperoxidase (MPO) in intestinal tissue of mice was measured; Inflammation related factors nucleotide binding oligomerization domain 2 (), nuclear factor-κB p65 (), tumor necrosis factor-α () and interleukin-6 () mRNA expressions in intestinal were detected by qRT-PCR; Lipopolysaccharide (LPS), TNF-α, IL-6 levels in serum were determined by ELISA; Diversity and abundance of intestinal flora in mice were detected by 16S rDNA high throughput sequencing.Compared with model group, DAI score of mice in punicalagin group was significantly decreased (< 0.01); Congestion and edema of small intestinal mucosa were significantly alleviated; Expressions of small intestinal epithelial tight junction associated proteins ZO-1 and Occludin were significantly increased (< 0.01); MPO activity in intestinal wall was significantly reduced (< 0.01);,,andmRNA expressions in intestinal wall were decreased significantly (< 0.01); LPS, TNF-α and IL-6 levels in serum were significantly decreased (< 0.01); Relative abundances of Firmicutes, Lachnospiraceae and Clostridiales-unclassified were significantly increased (< 0.01), relative abundances of Proteobacteria, Bacteroidetes, Muribaculaceae and Desulfovibrionaceae were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Punicalagin can improve enteritis induced by pathogenicO101, reduce the inflammatory response of mouse intestinal wall, and protect the intestinal mucosal barrier, and its mechanism may be related to the regulation of intestinal flora.

punicalagin; bacterial enteritis; intestinal flora; intestinal mucosal barrier; inflammatory response

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3044 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.014

2022-01-25

安徽省高校自然科學重大項目（KJ2020ZD56）；大學生科研資助金項目（WK2020S59，WK2021XS61）

黃淑蕓（1997—），女，碩士研究生，研究方向為腸道菌群與中藥研究。Tel: 13770658183 E-mail: 2418481384@qq.com

通信作者：鐘樹志，碩士生導師，教授，主要從事中樞神經(jīng)退行性變與中藥調(diào)節(jié)研究。E-mail: zhongshuzhi2006@163.com

[責任編輯 李亞楠]