舒 波，余金洪，王 濤*

半夏曲發(fā)酵機制及主要優(yōu)勢真菌的發(fā)酵功能研究

舒 波1，余金洪2，王 濤2*

1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充 637000 2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，宜賓學院，四川宜賓 644000

探討半夏曲的自然固態(tài)發(fā)酵機制。采用免培養(yǎng)、純培養(yǎng)相結合的方法研究半夏曲發(fā)酵真菌和細菌區(qū)系構成及主要代謝功能，針對分離到的主要優(yōu)勢真菌的純培養(yǎng)菌株，分別采用碘量法及分光光度法檢測其產淀粉酶及蛋白酶情況，采用顯微鏡觀察菌株對草酸鈣結晶的破壞情況。半夏曲發(fā)酵過程中檢測到絲衣孢霉、根霉、曲霉、米勒酵母、假單胞菌、芽孢桿菌等屬微生物。半夏曲發(fā)酵過程中真菌數(shù)量大幅增殖，前期及末期的真菌多樣性遠遠高于發(fā)酵旺盛期，發(fā)酵40～64 h期間的樣品與其他樣品的真菌區(qū)系構成存在極顯著差異（＜0.01）。絲衣孢霉屬是唯一參與了整個半夏曲發(fā)酵過程的優(yōu)勢真菌，對米勒酵母、根毛霉、曲霉的生長具有明顯抑制作用。細菌的數(shù)量及多樣性均低于真菌，且其數(shù)量在半夏曲發(fā)酵過程中沒有明顯增長。微生物群落功能預測（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUS）分析表明半夏曲發(fā)酵過程中的真菌與氨基酸代謝、糖代謝及核苷酸合成代謝密切相關。真菌菌株發(fā)酵實驗證實，絲衣孢霉屬真菌與α-淀粉酶的生成及草酸鈣針晶破損有關。細菌不是半夏曲發(fā)酵過程中的主要功能微生物，絲衣孢霉是半夏曲發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢功能微生物，與半夏曲的淀粉酶活性和與刺激性降低密切相關。

半夏曲；發(fā)酵機制；真菌；絲衣孢霉；發(fā)酵功能；固態(tài)發(fā)酵；碘量法；淀粉酶；蛋白酶；草酸鈣；根霉；曲霉；米勒酵母；假單胞菌；芽孢桿菌；氨基酸代謝；糖代謝；核苷酸合成代謝

半夏是天南星科半夏屬植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，盛產于四川地區(qū)，炮制后可用于消腫、燥濕化痰、降逆止嘔等，其炮制品半夏曲是多種中成藥的原料之一。半夏經發(fā)酵后能有效緩和半夏藥性，減少舌頭刺痛、喉嚨腫痛等毒副作用，同時還能增強降逆止嘔、鎮(zhèn)咳平喘等功效[1]。半夏曲發(fā)酵采用六神曲強化接種的自然發(fā)酵工藝，參與發(fā)酵的微生物主要來自六神曲、半夏原料及發(fā)酵環(huán)境，半夏曲發(fā)酵微生物菌群結構差異，是導致半夏曲質量差異的重要因素[2]。研究表明，半夏曲發(fā)酵過程中的細菌主要為芽孢桿菌屬、單胞菌屬等，真菌主要有宛氏擬青霉、絲衣霉菌、釀酒酵母、淺白隱球酵母等[3]，其中宛氏擬青霉及絲衣霉菌具有產黃色素的能力[4]，但這些微生物在發(fā)酵過程中的主要作用機制仍不清楚，基于此，本研究針對半夏曲發(fā)酵過程中的微生物區(qū)系，研究其多樣性、變化趨勢及主要功能，為闡明半夏曲發(fā)酵機制提供支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV2800型紫外光分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；SJ-2D型超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司；LRH-70型真菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MSDDR701型顯微鏡，邁時迪科技有限公司；T100型PCR儀，美國BIO-RAD公司；SU8020型電子顯微鏡，日本日立高新技術公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 材料

清半夏飲片，四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號D2103058，經南充市食品藥品檢驗所雷果平副主任中藥師鑒定，為來源于天南星科半夏屬植物半夏(Thunb.) Breit.的塊莖切片經硫酸鋁鉀（白礬）溶液浸泡所得的炮制品；白礬，四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號2012157；六神曲，四川千方中藥股份有限公司，批號22102104；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；Fast DNATMSpin Kit for Soil試劑盒，天根生化科技有限公司；福林酚試劑，上海國藥化學試劑有限公司，分析純；-酪氨酸，天津科密歐化學試劑有限公司，質量分數(shù)≥98%；葡萄糖，天津致遠化學試劑有限公司，分析純。

2 方法

2.1 樣品采集

于四川雅安迅康藥業(yè)有限公司發(fā)酵車間內，按清半夏、生姜汁、白礬、面粉、六神曲以32∶4∶2∶6.4∶1的配比混合均勻后平鋪在托盤上，料層厚度3 cm左右，然后入室發(fā)酵，發(fā)酵溫度為35～37℃，濕度為80%～85%，發(fā)酵72 h，分別于發(fā)酵0、16.5、25、40.5、48、64.5、72 h及干燥后采用無菌取樣方法取半夏曲樣品（分別編號P0h、P16h、P24h、P40h、P48h、P64h、P72h、Pdry）及輔料六神曲（編號ML）共9個樣品，粉碎過100目篩備用。

2.2 細菌、真菌區(qū)系組成研究

按照Fast DNATMSpin Kit for Soil試劑盒說明書提供的方法提取樣品總DNA，電泳合格后送基因測序公司擴增其ITS1、ITS4[5-6]及16S rDNA[7]序列，過濾尾部質量值20以下的堿基及質控后50 bp以下的序列，再拼接，按最大錯配比率0.2篩選不符合序列，對優(yōu)化后的序列提取非重復序列，利用Usearch（vsesion 7.1）軟件平臺（http://drive5.com/ uparse/），將相似性在97%以上的非重復序列（不含單序列）劃為1個操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）并聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將測序獲得的所有OTU與Genbank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的模式菌株對應序列比對，獲取OTU前20種優(yōu)勢物種對應的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應的豐度信息[8-10]，對豐度排名前20的種屬構建關聯(lián)網絡，將測序得到的微生物組成映射到數(shù)據(jù)庫中，使用PICRUSt軟件（https://picrust.github.io/ picrust）對六神曲和半夏曲中的細菌及真菌的基因功能進行預測[11-12]，并參照基因功能數(shù)據(jù)庫京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進行注釋。

2.3 細菌、真菌的計數(shù)

稱取5 g樣品粉末于盛有45 mL無菌水的錐形瓶中混勻，制成1∶10的稀釋液；用無菌吸管吸取5 mL稀釋液于新的盛有45 mL無菌水的錐形瓶中，制成1∶100的稀釋液；重復此操作，依次得到稀釋梯度為1∶1000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000的稀釋液。分別取稀釋梯度為1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000的稀釋液1 mL，涂布到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后計數(shù)，每個稀釋度做3個重復。細菌的培養(yǎng)計數(shù)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，每個稀釋度做3個重復。

2.4 優(yōu)勢真菌的分離鑒定

挑取馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上長勢良好、無污染的單菌落，采用平板劃線法純化，3次純化后，在薄層（厚度不超過3 mm）馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長出菌絲，于倒置顯微鏡下直接觀察培養(yǎng)皿中的菌絲生長形態(tài)。

2.5 優(yōu)勢真菌產酶特性研究

針對發(fā)酵過程樣品，測定半夏曲在發(fā)酵過程中的α-淀粉酶和蛋白酶活力變化趨勢；針對接種真菌純培養(yǎng)菌株發(fā)酵72 h后的半夏曲及對照（接種六神曲自然發(fā)酵的半夏曲），測定其α-淀粉酶和蛋白酶活力。α-淀粉酶和蛋白酶活力分別采用碘量法及分光光度法測定[13]。

2.6 優(yōu)勢真菌減毒作用研究

清半夏、生姜汁、白礬、面粉按80∶10∶5∶16比例混合均勻后，分裝入500 mL三角瓶，每瓶裝量100 g，121 ℃滅菌20 min后分別接種絲衣孢霉、宛氏擬青霉28 ℃發(fā)酵64 h，以接種六神曲發(fā)酵的半夏曲為對照，在光學顯微鏡（150倍）和電子顯微鏡（1000倍）下觀察發(fā)酵后半夏曲中的草酸鈣針晶狀態(tài)。

3 結果與分析

3.1 半夏曲發(fā)酵過程中真菌區(qū)系變化趨勢

從表1可以看出，總體上，半夏發(fā)酵過程中檢測到的真菌種屬較少，發(fā)酵前期反映物種豐富度的Chao1指數(shù)最高，發(fā)酵0～24 h期間檢測到的OTU數(shù)量最多，也不超過140個OTU，發(fā)酵40 h后，僅檢測到3個真菌OTU，而序列條數(shù)大幅增加，即真菌種屬減少，數(shù)量增加，表明從發(fā)酵40 h開始，一些優(yōu)勢真菌逐漸取得群體優(yōu)勢，并抑制其他真菌的生長，直至發(fā)酵結束其生長減弱后其他真菌又開始生長。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要反映物種多樣性及分布均勻性，可以看出，發(fā)酵前期（0～40 h）及后期（64～72 h）真菌多樣性均遠高于發(fā)酵中期（40～64 h），這表明半夏曲的發(fā)酵過程實際上也是對半夏曲中真菌菌群的選擇馴化過程，僅有3個OTU的真菌在發(fā)酵旺盛期產生作用，1個OTU的真菌全程參與發(fā)酵。

表1 半夏曲發(fā)酵過程中真菌區(qū)系多樣性變化趨勢

進一步采用基于UniFrac距離群的加權（weighted）和非加權（unweighted）分析熱圖對半夏曲霉菌類群的β多樣性[14]進行了分析，發(fā)現(xiàn)半夏曲發(fā)酵過程中真菌區(qū)系組成及各種屬的豐度差異非常明顯，發(fā)酵前期和發(fā)酵末期半夏曲中的真菌區(qū)系構成沒有顯著差異（＞0.05），發(fā)酵40～64 h期間半夏曲中的真菌區(qū)系與發(fā)酵前期的差異達到極顯著（＜0.01），如圖1所示。盡管發(fā)酵40～64 h期間半夏曲中的真菌種屬數(shù)量遠少于發(fā)酵前期及末期（表1），但從平板計數(shù)結果來看（圖5），這一階段真菌數(shù)量急劇上升，最高達到4×106CFU/g，推測此時增殖的真菌主要是一些對半夏曲發(fā)酵環(huán)境適應良好的種屬，可能對半夏曲發(fā)酵有重要影響。

方格內數(shù)字從上到下分別代表加權指數(shù)、非加權指數(shù)及差異顯著性

圖2展示了半夏曲發(fā)酵過程中真菌區(qū)系構成及各真菌種屬的豐度變化趨勢，可以看出，僅有絲衣孢霉菌同時在六神曲和半夏曲發(fā)酵過程中被檢測到，推測該真菌可能是經由六神曲接種到發(fā)酵基質。絲衣孢霉菌全程參與了半夏曲發(fā)酵，其平均豐度達61.3%，特別是在發(fā)酵40～64 h期間該屬真菌豐度接近100%，表明絲衣孢霉菌是半夏發(fā)酵過程中的核心真菌。

除此之外，半夏曲發(fā)酵體系中豐度大于＞1%的真菌還有根毛霉、鏈格孢霉、根霉、曲霉等屬，但這些屬在六神曲中的豐度很低，推測其主要來自環(huán)境，且這些真菌在半夏曲發(fā)酵24 h后隨著絲衣孢霉逐漸取得生長優(yōu)勢而趨于消亡，至發(fā)酵72 h時僅有根毛霉、根霉屬真菌的豐度有所回升。

圖2 六神曲及不同發(fā)酵階段半夏曲中的真菌區(qū)系構成(A、B、C分別為樣品分組編號)

3.2 半夏曲發(fā)酵過程中細菌區(qū)系變化趨勢

從細菌區(qū)系組成來看，半夏曲不同發(fā)酵階段的細菌區(qū)系差異顯著（＜0.05），但優(yōu)勢種屬豐度相對穩(wěn)定（圖3）。發(fā)酵過程中假單胞菌的豐度在48～64 h期間超過70%，發(fā)酵完成干燥后的半夏曲中假單胞菌的豐度更是高達80%，且該細菌在六神曲中的豐度也高于80%，表明該細菌可能來自六神曲并對半夏曲發(fā)酵機制適應良好，同時，芽孢桿菌在半夏曲發(fā)酵過程中的平均豐度超過30%，特別是在發(fā)酵72 h時豐度超過80%（圖4），表明假單胞菌和芽孢桿菌是半夏曲發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢細菌屬。

3.3 半夏曲發(fā)酵過程中真菌、細菌數(shù)量變化趨勢

圖5展示了半夏曲發(fā)酵過程中真菌、細菌數(shù)量變化趨勢，可以看出，半夏曲發(fā)酵過程中其細菌、真菌的數(shù)量變化趨勢不同，發(fā)酵前期半夏曲內細菌較多，其數(shù)量超過1×106CFU/g，經過24 h的適應期后半夏曲中的細菌數(shù)量大幅下降，直至發(fā)酵結束均維持在較低水平，這可能是由于半夏、生姜等原料抑制了多種屬細菌的生長，僅有芽孢桿菌、假單胞菌等少數(shù)細菌可在半夏曲中存活，但也沒有明顯增殖，推測細菌不是半夏曲發(fā)酵的主要功能微生物。真菌數(shù)量在發(fā)酵49 h后急劇上升，到64.5 h時數(shù)量達到頂峰（4.0×106CFU/g），隨后略有下降，這說明了在半夏曲發(fā)酵過程中真菌有明顯增殖，推測真菌在半夏曲發(fā)酵過程中起主要作用。

方格內數(shù)字從上到下分別代表加權指數(shù)，非加權指數(shù)及差異顯著性

3.4 半夏曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢真菌的分離鑒定

通過培養(yǎng)法分離不同發(fā)酵階段半夏曲中的真菌，在發(fā)酵49～64 h的樣品中共分離到4株絲狀真菌，參考《真菌鑒定手冊》[15]，將這些真菌初步鑒定到絲衣孢霉屬、宛氏擬青霉屬、根毛霉屬及黑曲霉屬，圖6展示了3株分屬于絲衣孢霉屬、宛氏擬青霉屬、根毛霉屬的真菌菌落及菌絲形態(tài)。可以看出，絲衣孢霉菌落白色致密，孢子梗短小發(fā)達，有孢子囊；宛氏擬青霉菌落黃色，菌絲放射狀分布，橢圓形分生孢子呈串珠狀；根毛霉菌落呈白色絮狀，菌絲單一，無梗，頂端生孢子囊。

3.5 半夏曲發(fā)酵過程中真菌功能分析

圖7揭示了半夏曲發(fā)酵過程中各種屬真菌的互作關系，圖中紅色表示相互促進，藍色表示相互抑制，圓圈大小代表該屬真菌豐度?？梢钥闯?，半夏曲發(fā)酵過程中檢測到的真菌以子囊真菌為主，其中豐度最高的絲衣霉屬與其他真菌的相互作用最少，且主要體現(xiàn)為對其他真菌如米勒酵母、根毛霉、曲霉的抑制作用；米勒酵母與根毛霉、曲霉存在相互促進作用；鐮孢霉與其他真菌的相互作用最廣泛，可促進米根霉、鏈格孢霉、曲霉、青霉、米勒酵母的生長。這表明在半夏曲發(fā)酵過程中，絲衣霉屬通過抑制其他優(yōu)勢種屬取得生態(tài)優(yōu)勢，而相對弱勢的其他屬真菌則傾向于依賴相互之間的促進作用維持生態(tài)穩(wěn)定。

圖4 六神曲及半夏曲發(fā)酵過程中細菌區(qū)系構成(A、B、C分別為樣品分組編號)

圖5 半夏曲發(fā)酵過程中細菌與真菌的數(shù)量變化趨勢

圖6 優(yōu)勢真菌的菌落及培養(yǎng)基內的菌絲形態(tài)

圖7 半夏曲發(fā)酵過程中真菌屬水平相互作用網絡

圖8-a展示了半夏曲發(fā)酵過程中的微生物代謝以氨基酸代謝、碳水化合物代謝為主，其次為維生素代謝、脂質代謝等，微生物外源化合物的降解代謝能力從發(fā)酵前期至中后期，由增強到穩(wěn)定再下降，但其他方面的代謝強度，差異性不顯著（＞0.05），說明半夏曲中存在某種降解能力強的優(yōu)勢微生物。圖8-b顯示脂肪酸及甘露糖代謝強度隨發(fā)酵深度不同而存在差異，從發(fā)酵40 h開始，甘露糖的合成代謝及大分子物質的降解代謝趨于活躍，而脂肪酸代謝卻逐漸變弱，表明微生物在發(fā)酵中期大量降解含糖化合物為發(fā)酵后期的脂肪酸代謝合成脂質物質做鋪墊，而這又與優(yōu)勢菌屬的酶活力有密切關系。

圖8 半夏曲發(fā)酵過程中真菌區(qū)系代謝功能預測

圖9展示了半夏曲自然發(fā)酵過程中蛋白酶、α-淀粉酶活力及真菌、細菌數(shù)量變化趨勢?？梢钥闯?，半夏曲中α-淀粉酶活力與真菌數(shù)量變化趨勢高度相關，與細菌數(shù)量變化關系不大；蛋白酶活力與真菌、細菌數(shù)量變化關系均不明顯，表明真菌可提升半夏曲的促消化功能，這也進一步證實，半夏曲發(fā)酵過程中的功能微生物以真菌為主。

3.6 優(yōu)勢真菌發(fā)酵功能驗證

將分離純化的優(yōu)勢真菌及細菌純培養(yǎng)物單獨或組合發(fā)酵清半夏，以接種六神曲發(fā)酵的清半夏為對照，分析各種屬微生物對半夏曲酶活力的影響。從表2中可以看出，純菌發(fā)酵的淀粉酶、蛋白酶活性高于混菌發(fā)酵，表明各種屬菌株在產淀粉酶及蛋白酶方面可能存在不同程度的相互作用，如絲衣孢霉與根毛霉屬組合在發(fā)酵中后期的淀粉酶活性均低于對照，表明這2種微生物相互之間存在明顯的產淀粉酶相互抑制作用，從其他組合中也可看出，酵母可減少絲衣孢霉與根毛霉在產淀粉酶方面的相互抑制。比較各處理的α-淀粉酶活力，可以看出，接種枯草芽孢桿菌的處理在發(fā)酵90 h時淀粉酶活力達到最高，其次是宛氏擬青霉、絲衣孢霉，但發(fā)酵到120 h時，各處理的淀粉酶活力均大幅下降，這可能是由于發(fā)酵后期積累的有機酸抑制了淀粉酶活力；比較各處理蛋白酶活性，可以發(fā)現(xiàn)接種絲衣孢霉的清半夏蛋白酶活力在發(fā)酵48 h時達到最高，為對照的336%。上述結果表明，接種絲衣孢霉發(fā)酵的半夏曲可以獲得最大的α-淀粉酶活性及蛋白酶活性，如主要以α-淀粉酶活性作為質量監(jiān)控指標，發(fā)酵時間以90 h為宜，如主要以蛋白酶活性作為質量監(jiān)控指標，發(fā)酵時間以48 h或90 h為宜。

圖9 半夏曲發(fā)酵過程中微生物數(shù)量及酶活力變化趨勢

表2 純菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵半夏曲的酶活力比較

0%表示酶活力低于檢測閾值

0% indicates that the enzyme activity is lower than the detection threshold

3.7 絲衣孢霉及宛氏擬青霉對草酸鈣結晶的破壞作用

接種六神曲發(fā)酵后的清半夏毒性明顯降低，研究表明這主要由于發(fā)酵后半夏曲中的草酸鈣針晶被破壞，減少了對細胞的刺激性[16]。采用分離所得優(yōu)勢真菌發(fā)酵半夏曲，在光學及電子顯微鏡下觀察半夏曲發(fā)酵過程中草酸鈣針晶的形態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)絲衣孢霉、六神曲、宛氏擬青霉對草酸鈣針晶具有不同程度的破壞作用（圖10），特別是接種六神曲及以絲衣孢霉發(fā)酵64 h的半夏曲中的草酸鈣針晶斷裂缺口可在光學顯微鏡和電鏡下明顯觀察到，推測絲衣孢霉、宛氏擬青霉等可降低半夏中因草酸鈣針晶所導致的毒副作用。

半夏毒針晶是目前公認的半夏毒性來源，實驗發(fā)現(xiàn)半夏中的結晶簇在粉碎過程中大部分崩解，80目粉碎的未發(fā)酵半夏中大部分草酸鈣結晶為大于1000 μm的單束長針晶，其在發(fā)酵過程中經過微生物內呼吸分解轉化為活性成分而導致半夏毒性下降。表3展示了分別以六神曲及絲衣孢霉純培養(yǎng)物作為接種劑發(fā)酵半夏曲的情況下，不同發(fā)酵時間基質內草酸鈣針晶的數(shù)量。從表3可以看出，草酸鈣單束針晶隨發(fā)酵時間延長而遞減，且遞減速度逐漸變慢。與接種六神曲的對照相比，從48 h開始，接種絲衣孢霉的半夏發(fā)酵基質內草酸鈣針晶降解速度與對照有極顯著差異（＜0.01），到發(fā)酵64 h時，85%以上的單束長針晶已被降解，而此時對照中僅有61%的單束長針晶被降解，表明純菌發(fā)酵降解效率更高，能在短時間內降解大量草酸鈣針晶，但無論是六神曲還是純菌都不能完全降解基質中的草酸鈣針晶，且少量草酸鈣針晶的存在是否與藥物活性有關尚待進一步研究證實。

a-半夏原料 b-六神曲發(fā)酵后的半夏 c-絲衣孢霉發(fā)酵后的半夏 d-宛氏擬青霉發(fā)酵后的半夏

表3 絲衣孢霉純菌發(fā)酵對草酸鈣針晶降解的影響(400倍下任選3個針晶測定)

與六神曲發(fā)酵相同時間比較：**＜0.01

**< 0.01same time fermented by medicated leaven

4 討論

郭佳佳等[3]認為半夏曲炮制過程中的優(yōu)勢霉菌為宛氏擬青霉（）、壯觀絲衣霉（）及黑曲霉（），本研究也在半夏曲發(fā)酵過程中檢測到上述真菌，從這些真菌的豐度來看，將半夏曲發(fā)酵過程中的主要功能真菌聚焦于來自六神曲的絲衣孢霉菌，與在酒曲、醬油曲等其他自然固態(tài)發(fā)酵體系中占優(yōu)勢的曲霉、根霉、毛霉等真菌相比，絲衣孢霉菌能夠在自然發(fā)酵體系中的眾多環(huán)境真菌中脫穎而出，不僅源于六神曲接種導致的數(shù)量優(yōu)勢，也基于對半夏曲發(fā)酵基質的良好適應性。這種與半夏物料相互依存的生態(tài)優(yōu)勢不僅是該真菌得以在半夏曲發(fā)酵過程中實現(xiàn)其功能的生態(tài)基礎，也為純菌發(fā)酵創(chuàng)造了有利條件，將絲衣孢霉的純培養(yǎng)物用于半夏曲發(fā)酵，對改善半夏曲產品標準化，實現(xiàn)中藥炮制工藝的可控化自動化有重要意義，但要將其用于半夏曲純菌發(fā)酵，還需要進一步優(yōu)化物料配比、料層厚度、溫濕度等半夏曲純菌發(fā)酵工藝參數(shù)，促使絲衣孢霉在半夏曲發(fā)酵基質中盡快形成生態(tài)優(yōu)勢，同時還需要深入探討其對半夏曲成分及活性的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，絲衣孢霉對半夏主要毒性成分草酸鈣針晶蛋白[17]呈現(xiàn)特殊的溶解破壞作用，且純菌發(fā)酵半夏時高產蛋白酶（蛋白酶活性在發(fā)酵48 h時達到對照的434%），推測這種溶解破壞作用很可能就是源于絲衣孢霉所產蛋白酶對草酸鈣針晶結合蛋白的降解，但由于半夏曲的毒性與活性可能相互依存，如何通過控制發(fā)酵條件使半夏曲的毒性、活性相互平衡，還有待進一步研究。

總體上，本研究將純培養(yǎng)及免培養(yǎng)方法相結合，研究半夏曲發(fā)酵機制，得到以下主要結論：（1）半夏曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌為絲衣孢霉屬、宛氏擬青霉、根毛霉屬等，優(yōu)勢細菌是假單胞菌、芽孢桿菌屬等，其中，以絲衣孢霉為主的絲狀真菌是半夏曲發(fā)酵過程中的主要功能微生物；（2）半夏曲發(fā)酵過程中的微生物代謝以氨基酸代謝、碳水化合物代謝為主，其次為維生素代謝、脂質代謝等；（3）絲狀真菌可改善半夏曲的促消化功能；（4）絲衣孢霉、宛氏擬青霉等可降低半夏中因草酸鈣針晶所導致的毒副作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Fermentation mechanism of(Banxiaqu) and fermentation function of main dominant fungi

SHU Bo1, YU Jin-hong2, WANG Tao2

1.Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Northern Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China 2.Sichuan Key Laboratory of Soild-state Fermentation Resource Utilization, Yibin University, Yibin 644000, China

To explore the natural solid-state fermentation mechanism of(Banxiaqu),The composition and main metabolic functions of fermentation fungi and bacteria were studied by culture and uncultured methods, and the isolated strains of main dominant fungi were detected on the amylase and protease production by iodometry and spectrophotometry respectively and observed by microscope on the destruction of calcium oxalate crystal.,,,,andwere involved in the fermentation of.The number of fungi increased significantly during the fermentation, and the fungal diversity in the early and late stage was much higher than that in the vigorous fermentation period.The fungal flora in the fermentative matrix during 40 h to 64 h were significantly different from other samples (< 0.01).was the only dominant fungi species in samples from all stages of the fermentation process of, and obviously inhibited the growth of,and.The number and diversity of bacteria was lower than that of the fungi, and the number had not increased obviously.Picrust functional prediction analysis showed that fungi infermentation were closely related to amino acid metabolism, glucose metabolism and nucleotide synthesis metabolism.Fermentation by fungi strains showed that the, not bacteria, was related to producing of α-mylase and the damage of calcium oxalate crystal.were the main dominant functional microorganisms in the fermentation of, which were mainly contributed to the amylase activity and lower irritation of Banxiaqu.

Banxiaqu; fermentation mechanism; fungi;; fermentation function; solid-state fermentation; iodometry; amylase; protease; calcium oxalate;;;;;; amino acid metabolism; glucose metabolism; nucleotide metabolism

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 3022 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.012

2021-12-14

南充市科技局基金項目（19SHZ0450）

舒 波（1981—），男，學士，研究方向為中藥炮制工藝。Tel: 15181786677 E-mail: 30387948@qq.com

通信作者：王 濤，教授，主要從事固態(tài)發(fā)酵技術研究。E-mail: 289615848@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]