王 丹，吳小娟，劉小剛，蘭 余，吉 喆，吳衛(wèi)宇，馬 康，周成坪，袁 強，羅 爽，鄧有輝

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000）

葛根素是從豆科植物葛根中提取的一種異黃酮類化合物，具有抗心律失常、抗心肌缺血、擴張血管、改善微循環(huán)、降血脂、降血糖、增加腦血流量、保護腦神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化、防醉酒、治醉酒和對抗酒精性肝損傷等作用。隨著人們健康意識的不斷提升，葛根被應(yīng)用到食品、藥品等多個領(lǐng)域。葛根酒是一類健康養(yǎng)生酒，以傳統(tǒng)白酒為酒基，葛根為主要原料，輔以其他食藥原材，經(jīng)現(xiàn)代萃取技術(shù)將食藥材中的風(fēng)味、活性等成分融入到酒體中，形成在風(fēng)味、口感上區(qū)別于傳統(tǒng)白酒的養(yǎng)生酒。近年來，葛根酒市場發(fā)展比較快，受到消費者喜愛。

目前，對于原料中葛根素的檢測已有相關(guān)研究，如高效液相色譜法、分光光度法、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法、近紅外光譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等分析方法，其中高效液相色譜法檢測效果較好。然而，對于酒類中的葛根素檢測卻鮮有報道。在酒體中乙醇及其他原輔料成分可能會對葛根素的檢測造成干擾，影響穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度。本試驗主要探討葛根養(yǎng)生酒中葛根素含量的高效液相色譜（HPLC）檢測法，優(yōu)化相關(guān)檢測參數(shù)，以期為養(yǎng)生酒葛根素含量檢測提供快速可靠的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

葛根養(yǎng)生酒樣品：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

試劑及耗材：甲醇、冰乙酸均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水符合GB/T 6682中一級水的規(guī)定。

儀器設(shè)備：LC 1260 II 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；超純水制備儀，美國Millipore公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜檢測條件

色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ C水相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：250 nm，進樣量：10 μL；流動相：甲醇（A）-0.1 %乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：精密稱取10.0 mg 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至10 mL，混勻，得濃度為1.00 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

葛根素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：用水將葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 樣液制備方法

葛根素含量＞100 mg/kg 的養(yǎng)生酒：根據(jù)其含量，稱取混勻試樣2～5 g（精確至0.0001 g），用水稀釋成適當(dāng)濃度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜分析。

葛根素含量≤100 mg/kg 的養(yǎng)生酒：稱取混勻試樣10 g（精確至0.0001 g），水浴加熱去除乙醇，加水溶解轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶，定容后搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相配比與洗脫方式選擇

選擇不同流動相進行系統(tǒng)適用性比較，分別試驗比較了甲醇-水（30∶70）、甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）下的出峰情況，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水（30∶70）時，上機采集20 min 內(nèi)目標(biāo)峰不出；采用甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）等度洗脫時，13 min 左右出現(xiàn)目標(biāo)峰且峰形較好，綜合考慮時間成本，選擇甲醇-0.1 %乙酸水作為流動相。

分別考察了甲醇-0.1 %乙酸水等度洗脫和梯度洗脫效果，采用甲醇-0.1 %乙酸水（30∶70）等度洗脫時，雜峰在目標(biāo)峰出現(xiàn)后近20 min內(nèi)仍不能完全流出，會嚴(yán)重干擾下一針采集，故采用甲醇-0.1%乙酸水梯度洗脫的方式，洗脫程序見表1，結(jié)果表明，梯度洗脫效果較好，該條件下葛根素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液及不同方法制備的酒樣供試液色譜圖

2.2 樣品前處理方法的選擇

考慮到以葛根為主要原料的養(yǎng)生酒樣若直接過濾進樣檢測，乙醇可能對峰型和葛根素含量有影響，對高葛根素含量（＞100 mg/kg）養(yǎng)生酒采用經(jīng)水稀釋后過微孔濾膜再檢測。對葛根素含量（≤100 mg/kg）相對較低的養(yǎng)生酒，為避免過度稀釋對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，同時提高檢測響應(yīng)值，考察了水浴除去乙醇后加水定容樣和不除去乙醇樣對檢測時出峰峰型和葛根素含量的影響。

結(jié)果（見圖1）表明，是否水浴加熱除去乙醇對葛根素含量無較大影響，但不除去乙醇會造成葛根素色譜峰前拖尾，色譜峰較寬，在6.3 min 附近多1個雜峰。同時采用加標(biāo)回收試驗進一步考察水浴加熱除乙醇下葛根素的熱穩(wěn)定性，酒樣在20 mg/kg加標(biāo)水平下的檢測結(jié)果表明，葛根素的平均加標(biāo)回收率為99.8 %，說明葛根素回收率高，熱穩(wěn)定性良好。綜合考慮到當(dāng)色譜柱柱效下降后，不除去乙醇樣品色譜峰峰型可能會變差，故選擇采用水浴加熱法處理葛根素含量（≤100 mg/kg）相對較低的養(yǎng)生酒樣。

2.3 檢出限、定量限和線性關(guān)系

當(dāng)葛根素標(biāo)液稀釋至濃度為0.10 mg/L 進行上機檢測時，信噪比為5.8，更低稀釋濃度時，信噪比小于3，因此，將0.10 mg/L 確定為儀器最低檢測濃度。取6 份陰性空白酒樣10 g，以0.10 mg/kg 水平加入葛根素標(biāo)液，水浴揮發(fā)乙醇后，加水轉(zhuǎn)移定容至10 mL 容量瓶，上機測定，發(fā)現(xiàn)6 次加標(biāo)測定信噪比均大于3，結(jié)合直接稀釋葛根素標(biāo)液濃度為0.10 mg/L 時信噪比，按照信噪比S/N≥3 和S/N≥10 確定方法檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg。

取濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L 的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的色譜條件上機檢測。以葛根素質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出葛根素濃度在1.0～120 mg/L 范圍內(nèi)時，峰面積y與質(zhì)量濃度x 呈良好線性關(guān)系（y=45.849x-6.1179，R=0.9999）。

2.4 精密度試驗

精密吸取同一酒樣，按優(yōu)化后的方法制備供試樣液，重復(fù)進樣測定6 次，計算出峰時間和峰面積（n=6）的RSD，結(jié)果見表2。

由表2 可知6 次測定的保留時間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，表明儀器精密度良好。

表2 6次平行測定的保留時間和峰面積

2.5 重復(fù)性試驗

取兩個葛根素濃度水平的養(yǎng)生酒即樣品A 和樣品B 各1 批次，每批次樣分別平行稱定6 份，按照優(yōu)化后的方法制備供試液各6 份進樣測定，測得結(jié)果見表3。由表3 可知，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%、1.9%，方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)

2.6 加標(biāo)回收率試驗

精密稱取約10 g 養(yǎng)生酒陰性空白樣品，按照0.40 mg/kg、4.0 mg/kg、40.0 mg/kg 3 個濃度水平添加葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2 項下優(yōu)化后的供試樣制備方法和色譜條件進行檢測，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表4。

表4 樣品在不同加標(biāo)濃度下的回收率(n=6)

由表4 可以看出，該養(yǎng)生酒中葛根素含量的檢測方法回收率良好且比較穩(wěn)定，符合GB/T 27404—2008附錄F中對回收率的要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一個養(yǎng)生酒供試樣溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h 上機測定，測得其響應(yīng)峰面積見表5。由表5 可知，在48 h 內(nèi)測得的響應(yīng)面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10 %，表明樣品試樣溶液放置于室溫下48 h內(nèi)測定仍能滿足檢測精密度要求。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了高效液相色譜條件，篩選了適用于不同葛根素濃度水平的養(yǎng)生酒樣品前處理方法，建立了高效、適用的HPLC 方法測定養(yǎng)生酒中葛根素的含量。該方法在1.0～120 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R為0.9999，線性方程y=45.849x-6.1179，方法檢出限、定量限分別為0.10 mg/kg、0.40 mg/kg；儀器精密度較好，響應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22 %；方法重復(fù)性較好，兩個不同葛根素濃度的養(yǎng)生酒樣品6 次平行試驗測定結(jié)果分別為2765.1 mg/kg、11.5 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%、1.9%；養(yǎng)生酒樣品在加標(biāo)濃度為0.4 mg/kg、4.0 mg/kg 和40 mg/kg 3 個水平下，回收率范圍為90.52 %～93.98 %（n=6），相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 為0.57%～2.37%，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。該方法操作簡單，具有檢測靈敏度高、分析時間短、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠的特點，是檢測養(yǎng)生酒中葛根素含量的有效方法。