陳潤銘　杜玉青　李友山　劉亞莉　劉鳳桐　謝存香　安琪　董學宇

摘要 目的：探索復方黃柏液對內(nèi)皮細胞增殖遷移成管影響的機制，為復方黃柏溶液用于治療糖尿病足潰瘍提供依據(jù)。方法：用CCK-8法檢測藥物毒性，探索復方黃柏液使用的最佳藥物濃度、CCK-8法檢測細胞增殖活力、細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率、成管實驗檢測細胞成管能力、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）實驗檢測蛋白表達水平的變化。結果：使用復方黃柏液后，高糖組內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管能力較前有了提高，并降低了促血管生成素2（Ang-2）蛋白水平，增加血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和磷酸化酪氨酸激酶受體-2（P-Tie）蛋白水平。結論：復方黃柏液通過促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管以及影響蛋白表達水平，改善內(nèi)皮功能障礙來實現(xiàn)對糖尿病足潰瘍的恢復。

關鍵詞 復方黃柏液;中藥復方制劑;內(nèi)皮細胞;增殖;遷移;成管;機制;糖尿病足潰瘍

Effect and Mechanism of Fufang Huangbai Liquid on Proliferation，Migration，and Tube Formation of Endothelial Cells

CHEN Runming，DU Yuqing，LI Youshan，LIU Yali，LIU Fengtong，XIE Chunxiang，AN Qi¹，DONG Xueyu

（1 Department of Peripheral Blood Vessels，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China;

2 Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China;

3 Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050013，China）

Abstract Objective：To explore the effect and mechanism of Fufang Huangbai Liquid on endothelial cell proliferation，migration，and tube formation and provide evidence for the treatment of diabetic foot ulcer by Fufang Huangbai Liquid.Methods：Cell Counting Kit-8（CCK-8） was used for the detection of drug toxicity to determine the optimal concentration of Fufang Huangbai Liquid.Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay，cell migration rate by wound healing assay，tube formation ability by tube formation assay，and protein expression changes by Western blot.Results：After Fufang Huangbai Liquid treatment，the proliferation，migration，and tube formation abilities of endothelial cells in the high-glucose group were potentiated.Furthermore，the angiopoietin 2（Ang2） protein expression was reduced，and the protein expression levels of vascular endothelial growth factor（VEGF） and phosphorylated tyrosine kinase receptor-2（p-Tie2） were up-regulated.Conclusion：Fufang Huangbai Liquid can relieve diabetic foot ulcer by promoting endothelial cell proliferation，migration，and tube formation，affecting protein expression，and improving endothelial dysfunction.

Keywords Fufang Huangbai Liquid; Chinese medicinal compound preparations; Endothelial cell; Proliferation; Migration; Tube formation; Mechanism; Diabetic foot ulcer

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.006

糖尿病足是糖尿病最嚴重和危險的并發(fā)癥之一，它具有高致殘率、難愈合的特點。在最新版的糖尿病足防治指南指出，我國糖尿病足潰瘍的年發(fā)病率為8.1%，Wagner 3級以上的患者占到了45%，總截肢率19.03%，年死亡率為14.4%[1]。糖尿病足一旦發(fā)生，由于患者長期處于高血糖狀態(tài)，血管新生緩慢，愈合異常艱難。因而控制糖尿病足進一步惡化以及促進糖尿病足潰瘍的愈合是糖尿病足研究的重點和難題。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞具有促進血管新生的作用，而糖尿病足潰瘍則一直因為血管再生困難成為治療難題[2]。因而越來越多學者開始研究糖尿病足潰瘍與內(nèi)皮細胞的關系。張瑩[3]認為血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病足的始動環(huán)節(jié)，改善內(nèi)皮功能已經(jīng)成為糖尿病足治療的目標之一。李桃等[4]認為血管內(nèi)皮細胞是糖尿病足潰瘍愈合的重要參與者。除此之外，中醫(yī)藥與內(nèi)皮細胞的關系也受到了關注。有研究表明，中藥能夠通過提高內(nèi)皮細胞生長因子水平等多途徑來保護內(nèi)皮細胞[5]。

中醫(yī)外治在糖尿病足潰瘍治療中發(fā)揮著特色的中醫(yī)藥作用。塌漬法屬于外治法的一種，它最早見于《劉涓子鬼遺方》的“豬蹄湯洗瘡”，利用中藥熬制而成的溶液對傷口進行濕敷或者浸泡。復方黃柏液作為塌漬法的常用藥物之一，被廣泛應用于改善糖尿病足潰瘍、肛周膿腫、濕疹等疾病。其中復方黃柏液對促進糖尿病足潰瘍恢復效果尤為突出[6]。但復方黃柏液有關糖尿病足潰瘍的作用機制臨床鮮少報道。本研究探索復方黃柏液對內(nèi)皮細胞增殖遷移成管影響的機制，為復方黃柏溶液用于糖尿病足潰瘍治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 內(nèi)皮細胞購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術有限公司，批號：CL-463。內(nèi)皮細胞在37 ℃，5% CO條件下加入10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）在平衡鹽溶液（Earle′s Balanced Salt Solution，EBSS）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 復方黃柏液（山東漢方制藥，生產(chǎn)批號：19042011）;葡萄糖（上海國藥，生產(chǎn)批號：63005518）;氯沙坦（上海陶術生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：T0215L）

1.1.3 試劑與儀器 FBS（北京沃凱生物技術有限公司，批號：SH30084.03）;0.25%胰酶（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0205）;細胞計數(shù)試劑（Cell Counting Kit-8，CCK8）（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0037）;Matrigel基底膠（BD Incorporated公司，美國，批號：354248）;Calcein AM（鈣黃綠素乙酰甲酯）、麗春紅S（北京索萊寶科技有限公司，批號：P8330、型號：C7600）;BCA蛋白定量試劑盒（廣州賽國科技公司，批號：BL521A）;聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（millipore公司，美國，批號：HATF00010）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國，型號：8000）;低速離心機（上海盧湘儀，型號：TDZ4B-WS）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：IX71）;酶標檢測儀（Thermo公司，型號：MK3）;光學顯微鏡（上海精密公司生產(chǎn)，型號：XDS-1A）;電泳儀（BIO-RAD公司，美國，型號：mini protean 3 cell）;電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司生產(chǎn)，型號：PS-9）;一體式化學發(fā)光成像儀（上海勤翔科學儀器公司生產(chǎn)，型號：5300 Pro）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）CCK-8法檢測藥物毒性。實驗設置8個組，觀察組按照1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640（對應的濃度分別為20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL）給藥復方黃柏液，空白組只有培養(yǎng)基，不加入復方黃柏液。2）CCK-8法檢測內(nèi)皮細胞增殖實驗、細胞劃痕實驗、成管實驗;蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）實驗將設置A空白組、B高糖處理組（33 mmol/L）、C高糖處理組+復方黃柏涂液（1∶100、1∶200、1∶400）、D高糖處理組+氯沙坦（20 μmol/L）、E高糖處理組+復方黃柏涂液（1∶100）+氯沙坦（20 μmol/L）。

1.2.2 給藥方法 1）取處于對數(shù)生長周期的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)24 h后，在相應的孔中，加入濃度為20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL的復方黃柏液。2）A組僅保留培養(yǎng)基;B組給予33 mmol/L高糖處理;C組表示內(nèi)皮細胞給予33 mmol/L高糖后分別與濃度2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL的復方黃柏涂液（即原液1∶100、原液1∶200、原液1∶400）處理;D組表示內(nèi)皮細胞給予33 mmol/L高糖處理與20 μmol/L氯沙坦處理;E組表示內(nèi)皮細胞給予33 mmol/L高糖、2 mg/mL復方黃柏涂液和20 μmol/L氯沙坦處理。

1.2.3 檢測指標與方法 1）CCK-8法檢測藥物毒性實驗。將內(nèi)皮細胞復蘇，復蘇24 h后觀察細胞狀態(tài)。當細胞密度到達80%以上時，表示能傳代。用FBS漂洗2遍，加入0.25%的胰酶消化細胞，待細胞變圓后吸去胰酶，加入完全培養(yǎng)基終止消化。將細胞吹打為單細胞懸液，將細胞混勻;按一定的比例將細胞進行分盤，加適量培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，放入37 ℃、5%濃度的CO培養(yǎng)箱中;待細胞長至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞濃度為5×10 個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;24 h后，給每孔加入20 μL的CCK-8，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h;酶標儀450 nm波長測量光密度（Optical Density，OD），根據(jù)OD值進行細胞活性分析。抑制率=1-觀察組OD/對照組OD。2）CCK-8檢測內(nèi)皮細胞增殖實驗。將處于對數(shù)生長期的細胞調(diào)整細胞濃度為5×10 個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃，5% CO培養(yǎng)24 h，按照上述組別給藥24 h后，每孔加入20 μL的CCK8，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h測出OD值，分析細胞的增殖情況。3）細胞劃痕實驗。直尺、記號筆等實驗儀器操作前紫外照射30 min，用記號筆在3.5 cm皿背后大約每隔0.5～1 cm用直尺均勻地劃橫線，每孔至少穿過5條線。在3.5 cm蒸發(fā)皿加入約含3×10個細胞懸液，保證過夜細胞密度為90%左右。第2天用200 μL槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕。用FBS洗細胞3次，去除劃下的細胞。處理24 h后，顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，觀察細胞遷移情況。4）成管實驗，實驗前1 d，將Matrigel基質(zhì)膠放入4 ℃冰盒過夜溶解，槍頭盒、EP管、96孔板均4 ℃過夜預冷;次日在冰盒上進行鋪膠，將Matrigel基質(zhì)膠50 μL/孔加入96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min;在膠凝固的過程中，按照分組，準備細胞懸液，細胞消化后將細胞懸液濃度調(diào)整到1×10 個/mL。每孔接種10 000細胞，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后加入鈣黃綠素染色，鈣黃綠素氨酰酯（Calcein Acetoxymethyl Ester，Calcein AM）終濃度為0.25 μg/mL。鈣黃綠素染色30 min后于熒光顯微鏡下觀察拍照。5）Western Blotting實驗。按照分組給藥24 h后，用放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解細胞，并加入適量的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF），置于冰上裂解、離心后棄上清提取細胞總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒確定各組總蛋白濃度，然后通過蛋白定量結果上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulate（SDS）-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜。用麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜是否成功。封膜及孵育抗體、顯色拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，若符合正態(tài)分布，2組間比較采用配對樣本t檢驗，3組以上選擇單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。計數(shù)資料用百分率表示，采用χ檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 復方黃柏液對細胞的毒性呈濃度依賴性 測得OD值與抑制率結果顯示，濃度越高，抑制率越高，即復方黃柏液濃度越高對細胞毒性越大。其IC值為13.499 1 mg/mL。如圖1。

2.2 復方黃柏液增強高糖細胞活性 當內(nèi)皮細胞給予高糖處理后，OD值明顯下降，細胞數(shù)量減少，細胞活性顯著下降（P<0.01）。細胞高糖處理后給予復方黃柏液處理，細胞活性增強（P<0.01）。內(nèi)皮細胞高糖處理同時給予氯沙坦（20 μmol/L）處理，細胞活性相對高糖處理有一定程度的升高，而此時再給予復方黃柏液（1∶100）處理時細胞活性進一步增強（P<0.01）。見圖2。

2.3 復方黃柏液提高高糖細胞遷移能力 與對照組比較，高糖組細胞遷移率出現(xiàn)明顯下降（P<0.001）;與高糖組比較，加入復方黃柏液后，細胞遷移率有增長趨勢（P<0.05）;但當復方黃柏液濃度為1∶200、1∶400，此2組與高糖組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。高糖組給予氯沙坦（20 μmol/L）處理，細胞遷移較高糖組強（P<0.05），加入復方黃柏液后，細胞遷移能力進一步增強（P<0.01）。見圖3。

2.4 復方黃柏液促進細胞成管能力 7個組別在熒光顯微鏡成像，各組成管能力見圖4。與對照組比較，高糖導致細胞管腔數(shù)目減少，成管能力減弱（P<0.01）。加入復方黃柏液或氯沙坦后，細胞成管能力較高糖組增強（P<0.05），其中復方黃柏液的濃度增強，成管能力增強，但仍小于對照組。

2.5 復方黃柏液具有促進內(nèi)皮細胞生長的作用 Western Blotting結果顯示高糖導致促血管生成素2（Angiopoietin-2，Ang-2）蛋白水平增加（P<0.01），與較高糖組比較，加入復方黃柏液及氯沙坦的組別出現(xiàn)Ang-2蛋白水平降低（P<0.05）。高糖導致血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）蛋白水平和P-Tie2即磷酸化酪氨酸激酶受體-2（Endothelial-enriched Tunica Interna Endothelial Cell Kinase 2，P-Tie2）蛋白水平下降（P<0.01），而加入復方黃柏液及氯沙坦組別的VEGF和p-tie蛋白水平較高糖組升高（P<0.01）。見圖5。

3 討論

糖尿病足屬中醫(yī)學之“脫疽”，指發(fā)于四肢末端，嚴重時趾（指）節(jié)壞疽脫落的一種慢性周圍血管疾病。糖尿病足創(chuàng)面處理是目前治療糖尿病足潰瘍最主要的治療方式之一。常用的創(chuàng)面處理方式有用液體傷口敷料、生長因子進行換藥或封閉式負壓引流[7]。中醫(yī)的塌漬法則是在此基礎上提供的新選擇。塌漬法既無注射或口服給藥帶來的肝、腎損害，又不會破壞內(nèi)服藥物療效，具有綠色健康、療效顯著的特點。由于塌漬法有促進炎癥消退、去腐、改善瘡周微循環(huán)，促進肉芽生長的作用，所以塌漬法常被用于糖尿病足的治療[8]。

復方黃柏液是全國著名骨髓炎專家謝景龍主任醫(yī)師經(jīng)過30多年的外科臨床經(jīng)驗總結而來，他運用散結排膿、清熱解毒的連翹與能解毒療瘡、清熱燥濕的黃柏作為君藥，選用性苦甘寒，能夠清熱解毒散結的蒲公英與氣味芳香，透達祛邪，具有清熱解毒作用的金銀花共為臣藥來增強連翹、黃柏的排膿、解毒之功;蜈蚣具有通絡散結、退炎治瘡的功效。用量雖小卻能增強破血逐瘀功效。諸藥合用，有清熱解毒、消腫排膿、去腐生肌之功。中醫(yī)學認為脫疽在濕熱毒盛，熱盛肉期開始出現(xiàn)破潰，這個時期應該要用清熱解毒的藥物，而復方黃柏液是由清熱解毒藥物組成的復方溶劑。復方黃柏液直接作用于患處，易被創(chuàng)面吸收，使腠理開疏，藥力直達病所，促進靜脈、淋巴回流，改善患處周圍微循環(huán)，進而對潰瘍面起到一個消炎鎮(zhèn)痛、促進傷口愈合的作用。李友山等[9]和徐炯[10]將局部應用復方黃柏液涂劑沖洗及浸潤作為觀察組，用其他的洗劑作為對照組進行療效觀察。結果顯示觀察組的療效要優(yōu)于對照組（P<0.05），證實了復方黃柏液涂劑具有明顯促進糖尿病足潰瘍愈合的作用，然而復方黃柏液作用于糖尿病足潰瘍機制仍不明確。

已有研究證實內(nèi)皮細胞具有增強血管生成和促進傷口修復的作用，血管生成不足導致的傷口修復能力降低是糖尿病病足潰瘍難愈合的重要原因[11]。蘆陽和劉宏偉[12]認為內(nèi)皮細胞通過分泌，誘導自身的增殖參與血管新生。完整的血管形成需要經(jīng)歷內(nèi)皮細胞被激活，內(nèi)皮細胞遷移、增殖形成血管周圍的基質(zhì)以及萌芽狀結構、環(huán)狀結構[13]。因此內(nèi)皮細胞對傷口愈合起到至關重要的作用。本實驗選用的是人臍靜脈內(nèi)皮細胞，是血管生成實驗的經(jīng)典模式細胞[14]。根據(jù)內(nèi)皮細胞的生成過程，本研究設計了4個實驗，囊括血管生成的增值、遷移、成管基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌等過程，旨在挖掘復方黃柏液與血管內(nèi)皮細胞的關系，找到復方黃柏液治療糖尿病足的起效原因。

高糖組模擬的是糖尿病患者的細胞情況，高糖組加入藥物則反映的是糖尿病足潰瘍用藥之后的狀態(tài)，結果顯示運用復方黃柏液后的細胞遷移、成管、增殖都比高糖組細胞提高（P<0.05）。在之前的研究表明高糖會誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，造成血管新生困難[15]。而我們的實驗則發(fā)現(xiàn)復方黃柏液對內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管具有促進作用，進一步說明復方黃柏液能夠改善高糖導致的內(nèi)皮功能障礙。實驗中還增加了一組氯沙坦作為參照。管緋等[16]認為氯沙坦能增加血液的供應，改善受損的血液循環(huán)情況，促進糖尿病足潰瘍的愈合。鄭麗麗等[17]實驗發(fā)現(xiàn)氯沙坦通過影響晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End-products，AGEs）能夠減少糖尿病血管病變的發(fā)生。單純使用氯沙坦與氯沙坦、復方黃柏液聯(lián)合使用結果顯示，聯(lián)合使用的效果比單純應用氯沙坦要好（P<0.05）。這進一步說明了復方黃柏液對治療糖尿病足潰瘍有明顯療效。血管的生成還要受到多種因子的影響，尤其是受到生長因子的影響，因此生長因子的數(shù)量變化也可以側(cè)面反映出血管重建所處的狀態(tài)。Western Blotting實驗選取了內(nèi)皮細胞重建中的重要因子包括Tie-2、VEGF、Ang-2，通過復方黃柏液對這幾種蛋白的影響來觀察其對內(nèi)皮細胞的作用。VEGF誘導血管生成以及血管滲透，在血管生成調(diào)節(jié)中起著核心作用[18]。梁清月等[19]發(fā)現(xiàn)糖尿病足患者的VEGF水平要比血糖正常人低，這也說明VEGF水平變化可以起到評價糖尿病足療效好壞的作用。VEGF通過內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶家族的成員起作用，Tie-2的受體酪氨酸激酶就是成員之一[20]。它是最新發(fā)現(xiàn)的血管生成信號通路[21]。p-Tie2即磷酸化的Tie2，是Tie2的活化狀態(tài)，更能反映血管生成和血管結構的穩(wěn)定性。因此磷酸化水平越高，血管生成越穩(wěn)定。在本實驗中，VEGF和p-tie蛋白水平升高說明使用復方黃柏液后的內(nèi)皮細胞出現(xiàn)了一定的生長，也就是證實了復方黃柏能夠加速糖尿病足潰瘍創(chuàng)面內(nèi)皮細胞增殖進而促進創(chuàng)面愈合。Benigni等[21]認為血管緊張素系統(tǒng)在高血壓的病因和人類心臟和腎臟疾病的病理生理學中起著一定的作用。Ang-2是該系統(tǒng)的核心產(chǎn)物，Ang-2增加血管氧氣的產(chǎn)生，并誘導內(nèi)皮一氧化氮（Nitric Oxide，NO）合成酶脫鉤，從而進一步增強血管組織的氧化應激，因而降低了NO的可用性。當NO作用受限時，血管舒張功能也會受到限制[22]。而本研究結果顯示Ang-2下降，一氧化氮受限會減弱，其對血管內(nèi)皮細胞的保護作用得以保留。

綜上所述，復方黃柏液通過促進細胞增殖、遷移、成管以及影響蛋白表達水平來實現(xiàn)對糖尿病足潰瘍的康復，這為其治療糖尿病足潰瘍提供了理論依據(jù)，為進一步找到其治療靶點提供了實驗基礎。本研究也存在一些不足之處，未找到復方黃柏液作用于糖尿病足潰瘍的通路，從阻斷通路的途徑來反向證明復方黃柏液對糖尿病足潰瘍的作用，目前相關研究報道較少，缺乏驗證依據(jù)，課題組將在日后深入對復方黃柏液與內(nèi)皮細胞關系的研究，進一步完善復方黃柏液對血管內(nèi)皮細胞機制的研究。

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（2020-03-03收稿 本文編輯：王明）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973849-H2709）——基于AGEs-bFGF/PDGF-β通路研究中醫(yī)外治“溻漬法”促進糖尿病足潰瘍愈合的分子機制;北京中醫(yī)藥大學2017“青苗人才”計劃項目（DZMYS-201701）——中醫(yī)外治“溻漬法”（復方黃柏液涂劑）調(diào)控血管新生作用及其機制研究;北京中醫(yī)藥大學基本科研業(yè)務費項目（2016-JYB-JSPY-018）——中藥外治干預大鼠自體骨髓干細胞移植治療糖尿病潰瘍對miRNA-146a的影響

作者簡介：陳潤銘（1995.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)外科治療周圍血管疾病，E-mail：chenrm95@163.com

通信作者：李友山（1979.10—），男，博士，副教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向中醫(yī)外科治療周圍血管疾病，E-mail：lys4626@sina.com