周振祥，趙 博，王唯先，仝驍鵬，鄭劍波，李艷紅，高建明，羅 峰，孫守鈞，裴忠有

（天津農(nóng)學院, 天津 300384）

甜高粱(Sorghum dochna)作為普通高粱的變種，因其抗逆、耐旱、適應(yīng)能力強，且植株高大、莖稈富含糖分，是我國重要的能源作物和優(yōu)質(zhì)飼料作物，其莖稈的糖分主要由蔗糖、果糖、葡萄糖組成[1-2]。根據(jù)品種的不同，一般占可溶性總糖的95%以上。甜高粱莖稈含糖量是衡量其利用價值的重要標準。而準確測定甜高粱莖稈的可溶性糖含量，是甜高粱莖稈可溶性糖QTL定位的基礎(chǔ)和甜高粱莖稈糖分相關(guān)基因的克隆并進行功能驗證的前提。

育種者習慣用汁液錘度(Brix)和出汁量來估算可溶性糖產(chǎn)量[3]。但通過錘度法衡量莖稈可溶性總糖含量時，除了沒有統(tǒng)一的估算方法外，還存在無法分析糖組分的缺點。目前，在對可溶性糖進行分析時分別采用了不同的測定方法，方法各有優(yōu)缺點。孟利等[4]在分析甜高粱莖稈可溶性糖組分時，分別運用了蒽酮比色法、3,5-二硝基水楊酸法和離子色譜法測定了莖稈可溶性總糖含量、還原糖含量和可溶性糖的種類，均取得了較好的結(jié)果。趙大云等[5]在研究苜蓿多糖的測定方法中，對蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法進行了對比，結(jié)果顯示，蒽酮硫酸法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性則均優(yōu)于苯酚硫酸法，而且苯酚硫酸法在測定過程中存在反應(yīng)液體容易飛濺等試驗安全性問題[6]；宋占午等[7]對3,5-二硝基水楊酸法和蒽酮硫酸法進行了對比，結(jié)果顯示，3,5-二硝基水楊酸法的靈敏度要低于蒽酮比色法，而且3,5-二硝基水楊酸法的反應(yīng)試劑需要在室溫下保存7～10 d后才可使用，存在配制麻煩、耗時的缺點[8]；在使用斐林試劑比色法的顯色試劑次甲基藍與空氣接觸容易發(fā)生氧化，易對顯色結(jié)果造成影響[9]；在使用高效液相色譜法測定甜高粱莖稈中的可溶性糖含量存在儀器昂貴，維護復(fù)雜[10]等缺點。綜上所述，蒽酮比色法操作簡便、反應(yīng)快速等優(yōu)缺點[11]，但對糖組分含量的測定存在問題還需改進[12-14]。因此本研究在蒽酮比色法基礎(chǔ)上通過優(yōu)化反應(yīng)條件和樣品處理方法，對測定總糖、蔗糖、果糖的條件進行探究，為甜高粱莖稈可溶性糖含量測定尋找最便捷有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗試驗材料

‘忻粱52’與‘W452’重組自交系群體F8代255個于2019年4月30日于天津靜海區(qū)良種場種植，行長2.5 m，行間距0.5 m，株距0.2 m進行，田間管理同常規(guī)大田生產(chǎn)。于蠟熟期收獲去掉葉、葉鞘和穗柄，留下莖稈部分用榨汁機對其進行2次榨汁，測定錘度后收集至5 mL離心管作為待測樣本。

1.2 溶液配制

1) 85%硫酸：取780 mL濃硫酸(98%)，緩慢加入水中，定容至1 L。

2) 0.1%蒽酮溶液：取0.1 g蒽酮溶于100 mL 85%的硫酸中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

3)葡萄糖、果糖、蔗糖標準糖液：準確稱取1 g葡萄糖、果糖、蔗糖分別溶于1 000 mL容量瓶中并用蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻后置于冰箱中冷藏備用，濃度為1 000 g·L-1。

1.3 標準曲線的繪制

分別配制0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1葡萄糖、果糖、蔗糖溶液，各自吸取1 mL到7個比色管中，然后加入蒽酮試劑4 mL，然后將系列標準溶液在100 ℃水浴10 min的條件進行反應(yīng)，在620 nm的波長下測定吸光值，并另取一組果糖的一系列標準糖溶液以50 ℃水浴3 min的條件進行反應(yīng)，在620 nm的波長下測定吸光值，并與100 ℃水浴后的果糖標液進行對比，若兩者顯色的吸光值一致，則可以直接采用50 ℃水浴3 min這組標液所繪制的標準曲線，否則應(yīng)對結(jié)果計算進行矯正，并以含糖量為橫坐標，吸光值為縱坐標，并通過Excel軟件繪制標準曲線(圖1)。

圖1 葡萄糖、果糖、蔗糖的標準曲線Figure 1 Standard curve of glucose, fructose and sucrose

1.4 材料處理

1)去蛋白：吸取甜高粱汁液置于2 mL離心管中，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清液置于2 mL離心管中，放入水浴鍋中100 ℃水浴10 min，再置于冰上冷卻5 min，112 000 r·min-1離心1 min，吸取上清液置于2 mL離心管中后。

2)去色素：向2 mL離心管中加入一小勺活性炭粉末(加入的量可以視顏色的深淺而定)，震蕩后65℃水浴加熱10 min，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清液2 mL離心管中，低溫保存，作為待測樣品。

3)確定稀釋倍數(shù)：選擇5組錘度從小到大的樣品，分別吸取1、2、4、6、8、10 μL原液，加入蒸餾水配至1 mL，用傳統(tǒng)蒽酮比色法進行測定，選出最合適的反應(yīng)體系。

1.5 測定方法的優(yōu)化

1.5.1可溶性總糖顯色條件的優(yōu)化

1)篩選合適的反應(yīng)溫度

向試管中加入1 mL標準葡萄糖溶液，然后加入蒽酮試劑4 mL，分別于50、60、70、80、90、100 ℃下水浴10 min，冷卻后于620 nm波長下測定吸光值，分析溫度對吸光值的影響。

2)篩選合適的反應(yīng)時間

向試管中加入1 mL標準葡萄糖溶液，然后加入蒽酮試劑4 mL，于100 ℃分別水浴0、1、4、7、10、13、16 min，冷卻后于620 nm波長下測定吸光值，分析時間對吸光值的影響。

1.5.2蔗糖處理條件的優(yōu)化

1)篩選合適稀堿濃度

以加入KOH的濃度為變量，向含有1 mL蔗糖、果糖、葡萄糖標準溶液的試管中分別加入濃度為1、2、3、4、5 mol·L-1的KOH溶液1 mL，再加入3 mL蒸餾水，放入水浴鍋中加熱10 min，去除果糖和葡萄糖，定容至10 mL，然后取1 mL樣品加入比色管中，再加入蒽酮試劑4 mL，然后加入沸水浴中加熱10 min，冷卻后于620 nm波長下測定吸光值，選出KOH最佳的處理的濃度。

2)篩選合適的稀堿處理時長

以加熱時間為變量，向含有1 mL蔗糖、果糖、葡萄糖標準溶液的試管中分別加入濃度為1 mol·L-1的KOH溶液1 mL，放入水浴鍋中分別加熱0、2、4、6、8、10、12 min，去除果糖和葡萄糖，定容至10 mL，然后取1 mL樣品加入比色管中，再加入蒽酮試劑4 mL，然后放入沸水浴中加熱10 min，冷卻后于620 nm波長下測定吸光值，選出最佳的處理時長。

1.5.3果糖顯色條件的優(yōu)化

1)篩選合適的顯色時長

以反應(yīng)時間為變量，分別向試管中加入1 mL標準葡萄糖、果糖、蔗糖溶液，并加入4 mL蒽酮試劑后，放入50 ℃水浴鍋中分別處理0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min后，冷卻后于620 nm波長下測定吸光值，選出最佳的顯色時長。

2)篩選合適顯色溫度

以反應(yīng)溫度為變量，分別向試管中加入1 mL標準葡萄糖、果糖、蔗糖溶液，并加入4 mL蒽酮試劑，分別放入35、50、65、80、100 ℃水浴鍋中加熱，分別加熱5 min后冷卻，于620 nm波長下測定吸光值，選出最佳顯色溫度。

1.6 葡萄糖的含量換算公式

將處理好的汁液按照最佳的試驗條件進行測定。依次測出樣品的總糖、蔗糖、果糖的吸光值，再通過公式估算出葡萄糖的含量。計算公式如下：

式中：G為在標準曲線上查出的總糖的含量(mg)；S為在標準曲線上查出的蔗糖的含量(mg)；F為在標準曲線上查出的果糖的含量(m)；Vs為提取液的總體積(m)；D為稀釋倍數(shù)；Vt為反應(yīng)體系的總體積。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性差異分析采用t檢驗，差異顯著設(shè)置為P＜ 0.05，差異極顯著設(shè)置為P＜ 0.01。分別對錘度和可溶性糖總量、可溶性糖、蔗糖、葡萄糖、果糖進行相關(guān)性分析，采用Excel 2020制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜高粱莖稈汁液樣品的前處理

2.1.1去除莖稈汁液中的蛋白質(zhì)

為了降低甜高粱汁液樣品中蛋白質(zhì)對顯色反應(yīng)的影響，通過煮沸處理達到去除蛋白的目的。通過蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍顯色反應(yīng)在分光光度計595 nm波長下吸光值建立蛋白的標準曲線，得到回歸方程為y= 0.598 6x+ 0.002 3，回歸系數(shù)為R2= 0.99。然后通過回歸方程計算部分樣品處理前后的蛋白含量(圖2)，可以看出，經(jīng)煮沸法處理后樣品的蛋白質(zhì)含量明顯下降。

圖2 樣品處理前后的蛋白質(zhì)含量對比Figure 2 Comparison of protein content of samples before and after treatment

2.1.2樣品的脫色處理

為了降低色素對顯色結(jié)果的影響，通過往樣品中加入活性炭粉末的方式來去除色素。隨機挑選10個顏色深淺不一的樣品進行處理，樣品經(jīng)處理后最終效果(圖3)表明，渾濁有色液體變得澄清透明，脫色效果明顯。

圖3 樣品脫色處理前后的對比Figure 3 Comparison of samples before and after decolorization

2.1.3樣品的稀釋處理

隨機挑選5組糖錘度差異較大的樣品分別稀釋不同倍數(shù)后測定吸光值，所有測定均重復(fù) 3次。當稀釋倍數(shù)為500～1 000倍時，各個錘度的樣品測得的吸光值都在標準曲線的線性范圍內(nèi)，但考慮到加入樣品的濃度太小，會導(dǎo)致誤差加大，本試驗選擇將處理后的樣品稀釋500倍后用于蒽酮比色法的測定(表1)。

表1 不同樣品的稀釋后的吸光值Table 1 Dilution results of different samples (Abs)

2.2 可溶性糖蒽酮比色法測定條件優(yōu)化

2.2.1可溶性總糖顯色條件的優(yōu)化

通過改變反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間得到可溶性總糖吸光值變化趨勢曲線(圖4)，控制反應(yīng)時間為10 min，改變處理溫度，樣品所測得的吸光值隨反應(yīng)溫度的升高而升高，在100 ℃水浴條件下吸光值達到最大，因此試驗中選擇的反應(yīng)溫度為100 ℃?？刂品磻?yīng)溫度為100 ℃，改變處理時間，當加熱時間達到7 min時，吸光值達到最大值，顯色反應(yīng)完全，因此本試驗選擇100 ℃水浴7 min為可溶性總糖測定的最佳反應(yīng)條件。

圖4 可溶性總糖測定中不同反應(yīng)條件對吸光值的影響Figure 4 Influence of different reaction conditions on absorbance value in the determination of soluble total sugar

2.2.2蔗糖含量測定的條件優(yōu)化

通過改變KOH處理樣品的濃度，可溶性糖吸光值變化趨勢不同(圖5)，當加入濃度為1 mol·L-1的KOH溶液1 mL后，樣品中葡萄糖和果糖的吸光值已經(jīng)基本上接近于0，而蔗糖吸光值不受影響，因此1 mol·L-1的KOH溶液加入可以有效去除汁液中葡萄糖和果糖，減少葡萄糖和果糖對蔗糖含糖測定的影響。通過加入1 mol·L-1的KOH溶液1 mL后進行不同時長處理，測得可溶性糖吸光值變化趨勢(圖5)，當反應(yīng)時長達到8 min時，葡萄糖和果糖溶液的吸光值已接近于0，而對蔗糖的吸光值沒有影響，說明此時KOH溶液已經(jīng)完全去除汁液中葡萄糖和果糖，因此后續(xù)蔗糖含量測定選擇將反應(yīng)時長控制在8 min。

圖5 蔗糖含量測定前不同樣品處理條件對吸光值的影響Figure 5 Effect of different sample treatment conditions on absorbance value before determination of sucrose

2.2.3果糖含量測定的條件優(yōu)化

在果糖測定中，為了獲得最佳的測定溫度，采用不同溫度處理來測定果糖吸光值的變化趨勢(圖6)。由圖可以看出，當反應(yīng)溫度在35 ℃時，果糖達到最大吸光值，而葡萄糖和蔗糖的吸光值接近于0，因此，可以確定在測定樣品中果糖含量時，溫度應(yīng)控制在35 ℃左右。控制反應(yīng)溫度為35 ℃時，對不同處理時長對果糖吸光值影響進行研究，當處理時長為3 min時，果糖溶液的吸光值達到最大值，因此本研究在測定果糖含量時應(yīng)選擇處理時長為3 min。

圖6 果糖測定中不同反應(yīng)條件對吸光值的影響Figure 6 Effect of different reaction conditions on absorbance value in determination of fructose

2.3 可溶性糖含量測定

2.3.1精密度試驗

取同一樣品平均分裝成15份，以試驗所得出的最佳條件分別測定可溶性總糖、蔗糖、果糖含量(表2)，可溶性總糖、蔗糖、果糖測定方法相對標準偏差為0.96%、1.88%、2.63%，說明該方法具有較好的精密度。

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Precision experimental results

2.3.2重復(fù)性試驗

選取9份已知含量的樣品溶液，分為3組，分別加入葡萄糖、蔗糖、果糖對照樣品10 μg，以試驗所得出的方法進行測定吸光度，求出回收率，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠(表3)。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery test results

2.3.3甜高粱群體莖稈汁液中可溶性總糖、果糖、蔗糖、葡萄糖含量的測定

在獲得可溶性總糖、果糖、蔗糖、葡萄糖以上測定參數(shù)后，本試驗對甜高粱群體后代282個樣品的含糖量進行測定，將所測得的結(jié)果由Excel軟件整理后導(dǎo)入SPSS工具進行作圖(圖7)，可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖的變化趨勢相同，可溶性糖含量較高的樣品，蔗糖、果糖、葡萄糖的含量都相應(yīng)較高，同時也可以看出汁液錘度和可溶性總糖含量之間存在相關(guān)性。通過使用SPSS工具對可溶性總糖與所有性狀進行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)分別為0.700、0.860、0.499，且呈極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)；蔗糖和果糖之間極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.956，但和葡萄糖間都存在顯著負相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.459，果糖與葡萄糖之間相關(guān)不明顯(P＞ 0.05)。同時對可溶性總糖含量與錘度之間進行相關(guān)性分析，錘度和可溶性糖總量之間的相關(guān)系數(shù)值為0.885，并且呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)。通過線性回歸分析，錘度和可溶性糖總量之間呈線性回歸，回歸方程為：錘度 = 37.082 × 可溶性糖總量 + 3.990，在測定甜高粱汁液錘度后，利用該公式可以估算出可溶性糖總量。

圖7 甜高粱汁液中可溶性總糖、果糖、蔗糖、葡萄糖含糖量的測定結(jié)果Figure 7 Determination results of soluble total sugar,fructose, sucrose and glucose in sweet sorghum juice

3 討論與結(jié)論

在果糖比色條件的優(yōu)化過程中，甜高粱汁液樣品在35 ℃的溫度下反應(yīng)3 min時所測得的結(jié)果并不理想，反應(yīng)時試管中往往會產(chǎn)生黃綠色和白色絮狀物，無法測定吸光值，通過延長反應(yīng)時間和震蕩無法消除這種絮狀物，但可以通過提高反應(yīng)溫度來消除，推測該種絮狀物可能是甜高粱汁液中某種糖的組分與硫酸發(fā)生不完全顯色反應(yīng)的結(jié)果。當反應(yīng)溫度提高至50 ℃，該種現(xiàn)象發(fā)生較少，且該條件下，葡萄糖和蔗糖對果糖的吸光值影響較小，可以忽略不計，可以選擇50 ℃反應(yīng)3 min作為果糖測定的反應(yīng)條件。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在室溫時加入蒽酮試劑易使葡萄糖與之發(fā)生顯色反應(yīng)，而在冰水條件下加入蒽酮試劑可以降低葡萄糖與試劑發(fā)生顯色反應(yīng)的影響，能減少試驗誤差[15]。本研究采用文獻[15]中的條件后，測得葡萄糖的吸光值減小，能降低葡萄糖對果糖測定的影響。硫酸的濃度和用量也會對顯色結(jié)果產(chǎn)生影響[16]，選用85%的硫酸能使得果糖充分脫水，效果最好，與本研究選用的條件相同。

本研究在可溶性糖和所有性狀之間極顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)蔗糖、果糖、葡萄糖逐一增大，蔗糖和果糖之間極顯著正相關(guān)，但與葡萄糖間存在顯著負相關(guān)關(guān)系。毛鑫等[17]研究結(jié)果與本研究相反，甜高粱莖稈汁液中果糖含量與葡萄糖含量顯著正相關(guān)，果糖與蔗糖則無顯著相關(guān)性，葡萄糖與蔗糖間正相關(guān)，推測可能是由品種間的差異和環(huán)境因素引起的。有研究表明[2]，在鹽堿脅迫下，甜高粱莖稈汁液的組分將會受到影響，各種糖分之間的相關(guān)性系數(shù)將會降低。Guden[18]在甜高粱基因型對相關(guān)性狀的影響中研究發(fā)現(xiàn)，果糖和葡萄糖濃度(r= 0.856**)極顯著正相關(guān)。劉海波等[19]發(fā)現(xiàn)，總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量會隨鹽脅迫程度加重呈先增加后降低的趨勢，且鹽脅迫會提高蔗糖的相對含量，但對葡萄糖和果糖的相對含量無影響。而本研究的甜高粱材料種植于天津靜海，土壤的類型為鹽化潮土，土壤含鹽量較高，這可以解釋為何本研究所得的結(jié)果會與其他學者的研究結(jié)果存在差異。

本研究通過對傳統(tǒng)蒽酮比色法測糖的條件進行優(yōu)化，尋找出了便捷有效的測定方法，解決了傳統(tǒng)的蒽酮比色法無法測定果糖、蔗糖含量的問題，同時與傳統(tǒng)的蒽酮比色法一樣，具有較好的精密度和穩(wěn)定性。而硫酸苯酚法[20-21]和3,5-二硝基水楊酸法[22-23]目前多用于多糖和可溶性總糖的測定，在果糖、蔗糖上的測定還尚無報道，相比之下，改良之后的蒽酮比色法更適用于甜高粱莖稈糖含量的測定。