崔彥農(nóng)，夏曾潤(rùn)，賈 文，柴薇薇，王文穎，王鎖民

（1. 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 富硒食品開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 / 安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心, 陜西 安康 725000）

土壤鹽漬化是限制植物生長(zhǎng)最主要的環(huán)境因素之一[1]。全球約10%的陸地和30%的灌溉地已受到不同程度鹽漬化的影響，每年造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)110億美元[2-3]。我國(guó)鹽漬化土地分布范圍廣且類(lèi)型復(fù)雜，總面積約為1億hm2[4]。研究表明，鹽脅迫會(huì)抑制大多數(shù)植物的光合作用，主要表現(xiàn)為光合速率降低、氣孔關(guān)閉和葉綠素含量減少等[5-7]；同時(shí)，鹽脅迫下植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)如最大熒光、最大光電子產(chǎn)率、潛在光化學(xué)活性、光系統(tǒng)(PS)Ⅱ有效光電子產(chǎn)量及光化學(xué)猝滅系數(shù)等也會(huì)明顯降低[8]。

鉀離子(K+)作為植物必需礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，是多種酶的活化劑，在維持蛋白結(jié)構(gòu)和膜電勢(shì)中發(fā)揮著重要作用，也是植物體內(nèi)最主要的無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一；同時(shí)K+還具改善氣孔運(yùn)動(dòng)、優(yōu)化光合性能、促進(jìn)光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)等功能[9-10]。由于K+容易被硅酸鹽和黏土顆粒吸附，因此自然條件下可供植物根系吸收的K+通常處于較低水平[11-12]。我國(guó)現(xiàn)有耕地中，有近三分之一的土壤缺K+，尤其是在西北干旱和半干旱地區(qū)，由于土壤貧瘠、氮肥和磷肥的大量使用使得土壤中K+進(jìn)一步流失，因此K+虧缺是限制這些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的另一主要環(huán)境因素[13]。

農(nóng)作物和牧草因長(zhǎng)期生長(zhǎng)在優(yōu)裕的耕作條件下，其抗逆性的遺傳潛力十分有限[14-15]。在全球氣候變化和人口不斷增加的背景下，利用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)手段提高農(nóng)作物和牧草對(duì)逆境的適應(yīng)能力已成為保證糧食安全的重要途徑之一[16]。因此研究并明晰植物的耐鹽機(jī)制將為農(nóng)作物和牧草抗逆性的遺傳改良提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)我國(guó)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展與生態(tài)環(huán)境建設(shè)具有重要的戰(zhàn)略意義[17]。

羅布麻(Apocynum venetum)是夾竹桃科羅布麻屬多年生灌木，對(duì)多種環(huán)境脅迫如干旱和鹽漬化具極強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此是防風(fēng)固沙、水土保持和荒漠綠化的理想樹(shù)種；同時(shí)羅布麻極高的藥理活性和纖維利用價(jià)值使其成為我國(guó)荒漠地區(qū)的重要資源植物[18-21]。前期研究[21-22]表明，羅布麻是一種典型的鉀營(yíng)養(yǎng)高效植物，其在低K+環(huán)境下可以維持極高的K+吸收和利用效率；同時(shí)，干旱脅迫下羅布麻可在地上部同時(shí)積累大量Na+和K+以提高葉片滲透調(diào)節(jié)能力。但目前有關(guān)該植物對(duì)低K+條件和鹽脅迫的光合響應(yīng)機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)，研究低鉀和正常鉀供應(yīng)水平下羅布麻幼苗葉片光合氣體交換、PSⅡ光化學(xué)活性及光能分配對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，以期揭示羅布麻對(duì)缺鉀和高鹽生境的適應(yīng)特性。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

于2015年5月采用扦插法培養(yǎng)羅布麻幼苗，試驗(yàn)用土為黃土與草炭土按10 : 1比例混合，全氮含量為0.74 mg·g-1，全磷含量為0.95 mg·g-1，有機(jī)質(zhì)含量為1.62 mg·g-1，K+含量為0.11 mg·g-1。待扦插苗生長(zhǎng)4周后，選取株高約10 cm、長(zhǎng)勢(shì)一致的扦插苗移栽至裝有1 kg培養(yǎng)土的花盆(口徑14.5 cm，底徑10.0 cm，高10.5 cm)中，每盆移植15株幼苗，并用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[2 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1KH2PO4，0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2，0.5 mmol·L-1MgSO4，60 μmol·L-1Fe-citrate，50 μmol·L-1H3BO3，10 μmol·L-1MnCl2，1.6 μmol·L-1ZnSO4，0.6 μmol·L-1CuSO4，0.05 μmol·L-1Na2MoO4，pH 5.7]培養(yǎng)。溫室晝夜溫度為25 ℃/19 ℃，相對(duì)濕度為60%，光強(qiáng)約為800 μmol·(m2·s)-1，光照時(shí)長(zhǎng)為16 h·d-1。移栽?xún)芍芎箝g苗，每盆保留8～10株生長(zhǎng)健壯的幼苗。

1.2 試驗(yàn)處理

間苗一周后將羅布麻幼苗隨機(jī)分為低鉀(0.01 mmol·L-1K+)組和正常鉀(2.5 mmol·L-1K+)組處理。低鉀組處理設(shè)置為：1)對(duì)照 Ⅰ：用含0.01 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(原營(yíng)養(yǎng)液中KH2PO4和KNO3分別用等濃度H3PO4和HNO3替換，0.01 mmol·L-1K+由KCl補(bǔ)充，用Tris溶液調(diào)pH至5.7)處理。2)輕度鹽脅迫：用含50 mmol·L-1NaCl及0.01 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。3)重度鹽脅迫：用含200 mmol·L-1NaCl及0.01 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。正常鉀組處理設(shè)置為：1)對(duì)照Ⅱ ：用含2.5 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(原營(yíng)養(yǎng)液中KH2PO4和KNO3分別用等濃度H3PO4和HNO3替換，2.5 mmol·L-1K+由KCl補(bǔ)充，調(diào)pH至5.7)處理。2)輕度鹽脅迫：用含50 mmol·L-1NaCl及2.5 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。3)重度鹽脅 迫：用含200 mmol·L-1NaCl及2.5 mmol·L-1K+的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。每3 d澆灌一次處理液，每盆每次澆灌量300 mL。處理5周后觀(guān)察到低鉀組重度鹽脅迫處理下的幼苗葉片開(kāi)始發(fā)黃，隨即測(cè)定各處理下植株光合速率、光合氣體交換及葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。所有參數(shù)均使用6株幼苗作為重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1光合氣體交換參數(shù)

用LI-6400便攜式光合測(cè)量系統(tǒng)(LI-COR，美國(guó))于08:30 - 11:30測(cè)定成熟功能葉的凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)，氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance, Gs)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr)及胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)等光合氣體交換參數(shù)。測(cè)定時(shí)，維持溫室中空氣CO2濃度(air CO2concentration, Ca)為410 μmol·mol-1，光強(qiáng) 為800 μmol·(m2·s)-1，溫 度 為25 ℃，相 對(duì) 濕 度 為50%～55%。最后計(jì)算葉片水分利用效率(water use efficiency, WUE)，WUE=Pn/Tr[23]，以及氣孔限制值(Ls) = 1 -Ci/Ca[24]。

1.3.2葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)

參照Z(yǔ)hang等[25]的方法，在溫室光周期開(kāi)始前用MINI-PAM葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，德國(guó))測(cè)定各處理下植株葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。測(cè)量利用飽和脈沖模式，首先開(kāi)啟檢測(cè)紅光[光強(qiáng)為0.5 μmol·(m2·s)-1，脈沖頻率為1 Hz]，得到葉綠素初始熒光(Fo)，再開(kāi)啟強(qiáng)飽和脈沖光[4 000 μmol·(m2·s)-1，0.8 s]測(cè)得最大熒光(Fm)。計(jì)算得出可變熒光(Fv)，F(xiàn)v=Fm-Fo。隨后 使用 光 化光[500 μmol·(m2·s)-1]和強(qiáng) 飽 和脈 沖 光[8 000 μmol·(m2·s)-1，0.8 s]照射羅布麻葉片，在執(zhí)行飽和脈沖前測(cè)得瞬時(shí)熒光(Ft)，每隔20 s照射一次飽和脈沖，測(cè)量光誘導(dǎo)的最大熒光(Fm′)。

從WinControl-3-3.21軟件輸出的結(jié)果中選取趨于穩(wěn)定的數(shù)值計(jì)算PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm) =(Fm-Fo)/Fm′潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo) = (Fm-Fo)/Fo以及實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ) = (Fm′-Ft)/Fm′、激發(fā)能量 捕獲 效 率(Fv′ /Fm′) = (Fm′-Fo)/Fm′、光化學(xué) 猝 滅(qP) = (Fm′-Ft)/(Fm′-Fo′)及 非 光 化 學(xué) 熒 光 猝 滅(NPQ) =Fm/Fm′- 1。以上公式均參考Schreiber等[26]。

PSⅡ吸收光能分配比例參照Demmig-Adams等[27]方法計(jì)算：光化學(xué)反應(yīng)能量(P) = (Fv′/Fm′) ×qP、天線(xiàn) 色 素 耗散 能 量(D) = 1 - (Fv′/Fm′)、非 光 化 學(xué) 反應(yīng)耗散能量(E) = (Fv′/Fm′) × (1 -qP)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，并用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan多重檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 不同K+水平下羅布麻幼苗葉片光合速率對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

對(duì)照條件下(未添加NaCl)，低鉀組植株P(guān)n與正常鉀組植株無(wú)明顯差異(圖1)，表明低K+脅迫對(duì)羅布麻光合作用無(wú)影響。不論是低鉀組還是正常鉀組，與對(duì)照相比，兩個(gè)NaCl處理，尤其是200 mmol·L-1NaCl處理，顯著降低了Pn(P＜ 0.05)，表明鹽脅迫嚴(yán)重抑制了羅布麻的光合作用。50 mmol·L-1NaCl處理下，正常鉀組Pn是低鉀組的1.5倍以上，這表明輕度鹽處理下介質(zhì)中足量的K+有助于改善羅布麻的光合性能。

圖1 低K+和正常K+處理下鹽脅迫對(duì)羅布麻幼苗葉片凈光合速率的影響Figure 1 Effect of salt stress on the net photosynthetic rate of Apocynum venetum seedlings under low and normal K+treatments

2.2 不同K + 水平下羅布麻葉片氣體交換對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

對(duì)照條件下(未添加NaCl)，正常鉀組植株Gs和Ls均顯著高于低鉀組植株(P＜ 0.05) (表1)，表明低K+供應(yīng)水平抑制了羅布麻氣孔開(kāi)放過(guò)程。不論在低鉀組還是在正常鉀組，相比于對(duì)照，兩個(gè)NaCl處理，尤其是200 mmol·L-1NaCl處理，大幅降低了Gs、Tr和Ci，而顯著提高了Ls(P＜ 0.05)，表明鹽脅迫通過(guò)限制氣孔開(kāi)放從而影響了植株蒸騰作用及對(duì)光合作用原料CO2的獲??；相反，不論是低鉀組還是正常鉀組，200 mmol·L-1NaCl處理后葉片WUE是對(duì)照條件下的3倍以上，說(shuō)明鹽脅迫雖然嚴(yán)重限制了蒸騰作用從而減少了水分向地上部的運(yùn)輸，但羅布麻能夠通過(guò)提高水分在葉片中的利用效率以維持光合器官的生長(zhǎng)。

表1 低K + 和正常K + 處理下鹽脅迫對(duì)羅布麻幼苗葉片氣體交換參數(shù)和水分利用效率的影響Table 1 Effect of salt stress on the gas exchange parameters and water use efficiency of Apocynum venetumseedlings under low and normal K + treatments

2.3 不同K+水平下羅布麻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

對(duì)照條件下(未添加NaCl)，低鉀組Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′、qP及NPQ與正常鉀組均無(wú)顯著差異(P＞ 0.05) (圖2)，表明低K+供應(yīng)水平對(duì)羅布麻PSⅡ的正常運(yùn)行未產(chǎn)生明顯影響。無(wú)論在低鉀組還是正常鉀組，相比于對(duì)照，50 mmol·L-1NaCl處理對(duì)上述參數(shù)均無(wú)影響，而200 mmol·L-1NaCl處理顯著降低了除NPQ外的上述參數(shù)(P＜ 0.05)，表明高鹽脅迫還影響了羅布麻PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能，從而進(jìn)一步抑制了植株的光合作用。

圖2 低K+和正常K+處理下鹽脅迫對(duì)羅布麻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Figure 2 Effect of salt stress on the chlorophyll fluorescence parameters of Apocynum venetum seedlings under low and normal K+treatments

2.4 不同K+水平下羅布麻葉片吸收光能分配對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

無(wú)論在對(duì)照還是NaCl處理下，羅布麻葉片吸收的光能中用于光化學(xué)反應(yīng)的部分(P)、天線(xiàn)色素耗散能量(D)和非光化學(xué)反應(yīng)耗散能量(E)的分配特征在兩個(gè)供K+水平之間均無(wú)顯著差異(P＞ 0.05) (圖3)，表明K+供應(yīng)水平對(duì)正常條件和鹽脅迫下羅布麻光能利用特征無(wú)影響。與對(duì)照相比，低鹽脅迫對(duì)P、D、E無(wú)影響，高鹽脅迫則顯著(P＜ 0.05)降低了P而提高了D和E (圖3)。

圖3 低K+和正常K+處理下鹽脅迫對(duì)羅布麻幼苗葉片吸收光能分配的影響Figure 3 Effect of salt stress on the light energy allocation of Apocynum venetum seedlings under low and normal K+ treatments

3 討論與結(jié)論

光合作用是植物進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程，在有機(jī)同化物的積累及能量的吸收、固定、分配與轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵作用[28]。本研究中，NaCl處理下羅布麻葉片Pn較對(duì)照條件下顯著降低(圖1)，表明鹽脅迫抑制了羅布麻的光合作用。同時(shí)，NaCl處理后羅布麻葉片Ci顯著下降而Ls顯著升高(表1)，表明鹽脅迫下植株葉片氣孔擴(kuò)散阻力增加，氣孔收縮，阻礙了外界CO2進(jìn)入葉肉細(xì)胞，導(dǎo)致光合碳固定底物減少，進(jìn)而引起光合速率降低，因此氣孔限制是鹽脅迫下羅布麻幼苗光合速率降低的主要因素。

維持氣孔的開(kāi)放對(duì)植物的蒸騰作用至關(guān)重要[29-30]。氣孔的開(kāi)放依賴(lài)于保衛(wèi)細(xì)胞體積的膨大，該過(guò)程主要通過(guò)將K+大量轉(zhuǎn)運(yùn)和積累至保衛(wèi)細(xì)胞中完成[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下(未添加NaCl)，低K+處理顯著降低了Ci，而顯著提高了Ls(表1)，表明低K+條件導(dǎo)致羅布麻氣孔開(kāi)放受阻；但Pn、Tr和Ci在低K+和正常K+處理下均無(wú)顯著差異(圖1和表1)，推測(cè)在低K+環(huán)境下羅布麻具特殊的機(jī)制以緩解氣孔因素對(duì)光合和蒸騰作用的限制，從而維持植株的生長(zhǎng)以及水分向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。兩種供K+水平下，添加NaCl顯著降低了Pn和Ci，而顯著提高了Ls(圖1和表1)，表明鹽脅迫下氣孔因素是限制羅布麻光合作用的主要原因，這可能是由于鹽處理后植物對(duì)K+的吸收會(huì)受Na+吸收的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使得植株葉中缺乏足夠的K+用以調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞體積所致。值得注意的是，鹽處理下羅布麻葉片水分利用效率較對(duì)照大幅度升高(表1)，這與另一種荒漠植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)葉片水分利用效率對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)趨勢(shì)類(lèi)似[33]，表明提高葉片水分利用效率可能是荒漠植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫引起的氣孔限制的重要生理機(jī)制之一。此外，50 mmol·L-1NaCl處理后，低K+組植株P(guān)n顯著(P＜ 0.05)低于正常K+組植株，但Ci在兩個(gè)供K+水平下無(wú)明顯差異(圖1和表1)，表明鹽脅迫下低供K+水平對(duì)羅布麻光合作用的抑制可能主要由非氣孔限制因素引起。

PSⅡ是環(huán)境脅迫下植物光合器官受損的原初位點(diǎn)之一，因此維持PSⅡ的正常運(yùn)行在植物適應(yīng)逆境中起著關(guān)鍵作用[26]。目前有關(guān)鹽脅迫對(duì)植物PSⅡ活性影響的報(bào)道較多，有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會(huì)抑制植物PSⅡ的功能[6]，但也有研究表明鹽脅迫對(duì)植物PSⅡ的活性無(wú)明顯影響或有促進(jìn)作用[34-35]。本研究中50 mmol·L-1NaCl處理對(duì)羅布麻PSⅡ功能無(wú)影響(圖2)；但200 mmol·L-1NaCl處理后，羅布麻葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、Fv’/Fm’及qP均顯著低于對(duì)照(圖2)，表明重度鹽脅迫對(duì)羅布麻PSⅡ造成了嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致了Pn的進(jìn)一步下降(圖1)。

逆境脅迫下，植物體內(nèi)的碳同化能力通常會(huì)減弱，導(dǎo)致光能利用率下降，因此植株會(huì)通過(guò)改變光能分配以緩解光能過(guò)剩的危害[36]。本研究中，低K+處理對(duì)羅布麻光能分配無(wú)明顯影響(圖3)。兩個(gè)供K+水平下，50 mmol·L-1NaCl處理下羅布麻幼苗葉片吸收光能的分配模式與對(duì)照無(wú)顯著差異(圖3)；但200 mmol·L-1NaCl處理后羅布麻通過(guò)降低光化學(xué)反應(yīng)能量的份額并增加天線(xiàn)色素和非光化學(xué)反應(yīng)耗散能量的份額來(lái)消耗過(guò)剩的光能(圖3)；NPQ表示植物熱耗散過(guò)剩激發(fā)能的能力[37-38]，本研究中200 mmol·L-1NaCl處理后NPQ較對(duì)照也明顯升高(圖2)，表明高鹽脅迫下羅布麻葉片通過(guò)提高熱耗散消耗過(guò)多激發(fā)能并降低用于光反應(yīng)的量來(lái)緩解過(guò)剩光能對(duì)光合系統(tǒng)的損傷。

綜上，羅布麻可通過(guò)維持較高的葉片凈光合速率以適應(yīng)低K+環(huán)境；雖然高鹽處理下羅布麻葉片凈光合速率、光合氣體交換和PSⅡ的活性均受到抑制，但其可通過(guò)提高葉片水分利用效率并增加熱耗散以減輕光合系統(tǒng)受到的危害。有關(guān)羅布麻光合作用對(duì)低鉀和鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制的進(jìn)一步深入研究將有望挖掘其抗逆關(guān)鍵基因用于提高傳統(tǒng)農(nóng)作物和牧草在逆境條件下的光合性能。